Induction of OTUD1 by RNA viruses potently inhibits innate immune responses by promoting degradation of the MAVS/TRAF3/TRAF6 signalosome.
包括体外细胞实验（HEK293T、MEFs等）、体内小鼠模型（Otud1-/-小鼠）、免疫共沉淀、泛素化分析、荧光共聚焦、ELISA、TCID50等，并包含功能验证和机制验证。
HEK293T细胞 Otud1+/+和Otud1-/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） Otud1-/-小鼠（VSV感染模型） 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）
OTUD1基因敲除小鼠（Otud1-/-）的构建和基因型鉴定 RNA病毒（SeV、VSV、H1N1）和DNA病毒（HSV）感染细胞或小鼠的剂量和途径 OTUD1过表达或敲低对MAVS/TRAF3/TRAF6蛋白水平的影响 Smurf1敲低对OTUD1介导的MAVS/TRAF3/TRAF6降解和IFNβ产生的影响 OTUD1去泛素化酶活性（C320A-H431Q突变体）对功能的影响
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证OTUD1是否参与RNA病毒诱导的先天免疫反应调控
在HEK293T细胞中敲低或过表达OTUD1，检测SeV感染后IFNβ mRNA水平；在Otud1+/+和Otud1-/- MEFs中感染RNA病毒（SeV、VSV、H1N1）和DNA病毒（HSV），检测IFNβ、ISGs（IFIT1、ISG15、ISG54）、TNFα和IL-6的mRNA水平；使用ISD和cGAMP刺激检测DNA-STING信号通路的影响。
验证OTUD1在体内对RNA病毒感染的抗病毒反应中的作用
用VSV腹腔注射或鼻腔感染Otud1+/+和Otud1-/-小鼠，检测肺、肝、脾等器官中IFNβ、IL-6和VSV mRNA表达，病毒载量，存活率，以及免疫组化检测VSVG蛋白。
验证OTUD1是否通过影响MAVS/TRAF3/TRAF6的蛋白稳定性和泛素化来发挥作用
在HEK293T细胞中梯度过表达OTUD1，检测内源MAVS、TRAF3、TRAF6、IRF3、TBK1和RIG-I蛋白水平；在Otud1+/+和Otud1-/- MEFs中检测这些蛋白水平；免疫沉淀内源MAVS/TRAF3/TRAF6检测泛素化水平；用MG132处理检测蛋白酶体依赖性降解。
验证Smurf1是否参与OTUD1介导的MAVS/TRAF3/TRAF6降解和干扰素抗病毒反应的抑制
在HEK293T细胞中敲低Smurf1，检测OTUD1对MAVS/TRAF3/TRAF6蛋白水平及泛素化的影响；检测OTUD1对SeV诱导的IFNβ产生的影响在Smurf1敲低条件下的变化；使用OTUD1去泛素化酶活性突变体（CH）检测其功能。
验证OTUD1是否通过去泛素化调节Smurf1的稳定性
检测OTUD1与Smurf1的相互作用；过表达OTUD1对Smurf1蛋白水平和泛素化的影响；使用泛素突变体（K48-only、K63-only）和K48特异性抗体分析泛素化类型；比较Otud1+/+和Otud1-/- MEFs中Smurf1蛋白和泛素化水平。
验证RNA病毒感染是否通过NF-κB信号通路上调OTUD1表达，并进而上调Smurf1蛋白水平
检测VSV或SeV感染HT1080、2fTGH等细胞中OTUD1 mRNA和蛋白表达时间过程；使用Vero（IFN缺陷）和U3A（STAT1缺陷）细胞验证NF-κB作用；用NF-κB抑制剂PDTC处理细胞检测OTUD1 mRNA；检测Smurf1 mRNA和蛋白质水平的变化在野生型和Otud1-/- MEFs中。
验证病毒感染是否促进OTUD1与Smurf1相互作用以及Smurf1向MAVS/TRAF3/TRAF6信号复合物的募集
在2fTGH细胞中用SeV感染，免疫沉淀内源OTUD1检测Smurf1相互作用；免疫荧光共聚焦检测OTUD1和Smurf1共定位；在BMDMs和2fTGH细胞中检测Smurf1与MAVS/TRAF3/TRAF6的内源结合；用MitoTracker染色观察Smurf1线粒体定位。
验证在病毒感染期间OTUD1-Smurf1轴对MAVS/TRAF3/TRAF6蛋白水平和IFNβ mRNA的调控
检测SeV感染HepG2、HeLa、BMDMs中MAVS/TRAF3/TRAF6蛋白和mRNA的时间过程；在HeLa细胞中敲低Smurf1检测其对SeV诱导的MAVS/TRAF3/TRAF6下调的影响；比较Otud1+/+和Otud1-/- BMDMs中VSV感染后的蛋白变化；检测Otud1-/- MEFs中IFNβ mRNA随时间的变化。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | GIBCO, Life Technologies | -- |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000-015 |
| LongTrans转染试剂 | UCallM | TF/07 | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| 药物处理 | MG132 | Sigma | C2211 |
| PDTC（NF-κB抑制剂） | -- | -- | |
| 刺激物 | cGAMP | InvivoGen | tlrl-nacga23 |
| Poly(I:C) | InvivoGen | tlrl-picr | |
| 脂多糖 | Sigma | L2630 | |
| 免疫荧光染色 | MitoTracker Red CMXRos线粒体染料 | Yeasen | 40741ES50 |
| DAPI | -- | -- | |
| OTUD1抗体 | Abcam | ab122481 | |
| Smurf1抗体 | Santa Cruz | sc-100616 | |
| 488山羊抗小鼠IgG | Alexa Fluor | A11001 | |
| 594山羊抗兔IgG | Alexa Fluor | A11012 | |
| 免疫印迹 | IRF3抗体 | Santa Cruz | sc-9082 |
| p-IRF3抗体 | Cell Signaling | 4947S | |
| OTUD1抗体 | Abcam | ab182511 | |
| Flag抗体 | Sigma | F7425 | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myc抗体 | Abmart | m2002 | |
| MAVS抗体 | Santa Cruz | sc-166583 | |
| TRAF3抗体 | Cell Signaling | 4729S | |
| TRAF6抗体 | Abcam | ab94720 | |
| TBK1抗体 | Cell Signaling | 3013S | |
| RIG-I抗体 | Cell Signaling | 4200S | |
| Smurf2抗体 | Santa Cruz | sc-25511 | |
| 泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| HA抗体 | Abcam | ab9110 | |
| K48-泛素抗体 | Cell Signaling | 4289S | |
| VSVG抗体 | Santa Cruz | sc-66180 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | 逆转录试剂盒 | Thermo | K1622 |
| 荧光素酶检测 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| ELISA | IFNβ ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0033C |
| 免疫组化 | 石蜡 | -- | -- |
| 细胞培养 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- |
| 质粒构建 | QuickChange定点突变试剂盒 | Stratagene | -- |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| PRIM培养基 | -- | -- | |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | Otud1-/-小鼠的构建，背景为C57BL/6，6-8周龄；VSV感染剂量和途径：腹腔注射2x10^8 pfu/只，或鼻腔感染2x10^7 pfu/只；样本量（每组n=4-12不等）。 阅读提示：见Materials and methods中'Mice'和'VSV infection in vivo'部分 |
| 细胞实验 | 细胞类型：HEK293T、HeLa、HT1080、2fTGH、HepG2、Vero、U3A、MEFs、BMDMs；病毒感染MOI=3（VSV、SeV、HSV），感染时间（通常1.5小时吸附后换液）；RNA病毒感染后检测时间点（如10小时） 阅读提示：见Materials and methods中'Cell culture'和'Viral infection in vitro'部分 |
| OTUD1/Smurf1功能验证 | OTUD1敲低或过表达；Smurf1敲低；OTUD1去泛素化酶活性突变体（C320A-H431Q）的使用；MG132使用浓度（20 μM）和处理时间（4小时） 阅读提示：见Results部分及Figure legends |
| 泛素化分析 | 泛素化检测方法（内源免疫沉淀或外源共转染）；泛素突变体（K48-only、K63-only）的使用；K48-Ub抗体检测 阅读提示：见Results部分及Figure legends |
| 分子检测 | q-PCR引物序列；q-PCR内参基因（β-actin）；IFNβ启动子报告基因（P125-Luc）和ISRE-Luc的检测；蛋白检测抗体信息及稀释比例 阅读提示：见Materials and methods中'Q-PCR assay'、'Assay of luciferase activity'和'Immunoprecipitation and immunoblotting'部分 |
