诱导细胞凋亡和ICD标志物分析
验证RA/IFNα处理是否在MCL和DLBCL细胞中诱导免疫原性细胞死亡。
用RA（1 μmol/L）和IFNα（1000 U/ml）处理Mino、SP53、DOHH2细胞5天，通过Annexin V/PI染色和Western blot检测凋亡，通过流式细胞术和ELISA评估ICD标志物（ecto-CRT、HSP70/90、HMGB1）和CD47表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用新策略诱导免疫原性细胞死亡以改进用于淋巴瘤免疫治疗的树突状细胞疫苗
Exploiting a new strategy to induce immunogenic cell death to improve dendritic cell-based vaccines for lymphoma immunotherapy.
实验完整度
高包含体外细胞系实验、小鼠体内实验和RNA-seq转录组分析，并进行了功能验证（细胞毒、吞噬）和机制验证（NF-kB、细胞因子）。
主要模型
Mino、SP53和Granta 519套细胞淋巴瘤细胞系 DOHH2弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系 A20小鼠淋巴瘤细胞系 hu-PBL-NOD-scid小鼠模型
重点核对
RA/IFNα处理浓度：1000 U/ml IFN-α和1 μmol/L 9-cis-RA 处理时间：5天（诱导凋亡和TCL制备） TCL制备方法：3次快速冻融循环 DC脉冲条件：100 μg TCL负载10^6个IFN-DC 体内疫苗接种方案：每4天、7天、14天注射2×10^6个负载TCL的IFN-DC
摘要
尽管前景广阔，但基于树突状细胞（DC）的疫苗的临床获益仍然有限，最佳抗原配方的选择仍是一个未解决的问题。我们开发了一种针对侵袭性和/或难治性淋巴瘤的新的DC疫苗接种方案，该方案结合了干扰素条件培养的树突状细胞（IFN-DC）的独有特征与源自经历免疫原性细胞死亡的淋巴瘤细胞的高免疫原性肿瘤细胞裂解物（TCL）。我们显示，用9-顺式维甲酸和IFNα（RA/IFNα）处理套细胞淋巴瘤（MCL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系可诱导钙网蛋白的早期膜暴露、HSP70和90，同时CD47下调并增强HMGB1分泌。一致地，与对照相比，RA/IFNα处理的凋亡细胞和TCL被DC更有效地吞噬。值得注意的是，用自体的RA/IFNα-TCL脉冲的DC产生的细胞毒性T细胞（CTL）更有效地识别并特异性裂解MCL或DLBCL细胞或负载有几种HLA-A*0201 cyclin D1或HLA-B*0801 survivin表位的靶标。这些培养物还显示Th1和Th17细胞扩增，以及Th17/Treg比率增加。此外，负载RA/IFNα-TCL的DC显示出增强的功能成熟和活化。用人类外周血淋巴细胞重建并用自体RA/IFNα-TCL负载的IFN-DC接种的NOD/SCID小鼠显示出淋巴瘤特异性T细胞反应，并且与用未脉冲或负载未处理TCL的IFN-DC处理的小鼠相比，肿瘤生长显著减少。本研究证明了使用RA/IFNα来产生高免疫原性TCL作为开发有效抗癌DC疫苗的合适肿瘤抗原配方的可行性和有效性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种新的DC疫苗策略，通过诱导淋巴瘤细胞免疫原性死亡，生成高免疫原性肿瘤细胞裂解物，以增强DC疫苗对侵袭性/难治性淋巴瘤的免疫治疗效果。
- 核心机制
- RA/IFNα通过诱导免疫原性凋亡，促进钙网蛋白和HSP70/90暴露、CD47下调及HMGB1释放，增强肿瘤细胞免疫原性；负载RA/IFNα-TCL的IFN-DC通过激活NF-kB信号、分泌促炎细胞因子，促进DC成熟活化和Th1/Th17免疫应答。
- 主要证据
- 体外实验显示RA/IFNα-TCL脉冲DC促进CTL和Th1/Th17细胞产生；体内实验显示hu-PBL-NOD-scid小鼠中RA/IFNα-TCL脉冲DC显著抑制肿瘤生长，并伴随血清IFNγ水平升高。
- 研究意义
- 为DC疫苗提供优化的抗原制备策略，并为后续开展Ⅰ/Ⅱ期临床试验（评估RA/IFNα-TCL-DC疫苗在复发/难治性DLBCL或MCL患者中的安全性、免疫原性和有效性）奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TCL制备和免疫原性验证
从RA/IFNα处理后的淋巴瘤细胞制备肿瘤细胞裂解物（TCL），并验证其免疫原性。
对处理或未处理的细胞进行3次冻融循环制备TCL，通过Western blot检测ICD标志物、ATP释放和DC吞噬实验验证TCL的免疫原性。
DC疫苗的体外功能验证
评估负载RA/IFNα-TCL的IFN-DC能否有效诱导肿瘤特异性CTL和辅助T细胞反应。
用TCL脉冲IFN-DC，与自体T细胞共培养，每周再刺激，共4次，然后进行细胞毒性实验（calcein-AM释放）和免疫表型分析（Th1、Th17、Treg）。
评估DC成熟和激活状态
研究RA/IFNα-TCL对DC成熟和激活的影响。
通过RNA-seq分析TCL脉冲DC的基因表达，通过吞噬实验（DQ-OVA）和细胞因子ELISA评估功能成熟，通过NF-kB核转位实验评估信号通路激活。
体内抗肿瘤效应评估
在免疫缺陷小鼠模型中评估RA/IFNα-TCL脉冲DC疫苗的治疗潜力。
建立hu-PBL-NOD-scid小鼠模型，接种人淋巴瘤细胞系（Mino），进行三次疫苗接种，监测肿瘤生长、体重和血清细胞因子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | 人干扰素α (IntronA) | SP Europe | -- |
| 9-顺式维甲酸 | Sigma | -- | |
| 重组小鼠干扰素α | Miltenyi Biotec GmbH | -- | |
| 多柔比星 | Sigma | -- | |
| Western blot | HSP70抗体 | Cell Signaling Technology | 4872 |
| HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | 4874 | |
| p-eIF2-α抗体 | Cell Signaling Technology | 9721 | |
| eIF2-α抗体 | Cell Signaling Technology | 9722 | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| PARP-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC8007 | |
| tubulin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC9104 | |
| 人钙网蛋白抗体 | Abcam | ab2907 | |
| DC脉冲 | 人钙网蛋白抗体[EPR3924]低内毒素无叠氮 | Abcam | ab211962 |
| Western blot | 小鼠钙网蛋白抗体 | Abcam | ab196159 |
| Noxa抗体 | Abcam | ab13654 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 兔IgG同型对照抗体 | Abcam | ab199093 | |
| HMGB1 1D9抗体 | Abnova | H00003146-M06 | |
| HRP标记二抗 | Bethyl laboratories | A120-111P | |
| 流式细胞术 | CD3 FITC抗体 | BD Biosciences | -- |
| CD4 PeCy7抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD8 BV421抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD25 APC抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD45RA AlexaFluor700抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD127 PerCP-Cy5.5抗体 | BD Biosciences | -- | |
| Ki-67 Pe-Cy7抗体 | BD Biosciences | -- | |
| TNF-α PE抗体 | BD Biosciences | -- | |
| IFN-γ PeCy7抗体 | BD Biosciences | -- | |
| IL-17 AlexaFluor647抗体 | BD Biosciences | -- | |
| HLA DR-PE抗体 | BD Biosciences | 555812 | |
| CD47-AlexaFluor647抗体 | BD Biosciences | 561249 | |
| CD11c-PE抗体 | Beckman Coulter | IM1760 | |
| CD11c-PC5抗体 | Beckman Coulter | IM3707 | |
| CD1a-PE抗体 | Beckman Coulter | -- | |
| CD80-PE抗体 | Beckman Coulter | IM1976U | |
| CD83-PE抗体 | Beckman Coulter | IM2218 | |
| CD86-PE抗体 | Beckman Coulter | 182729 | |
| CD127-Pe-Cy5抗体 | eBioscience | -- | |
| FoxP3 PE抗体 | eBioscience | -- | |
| IL-17 FITC抗体 | eBioscience | -- | |
| IL-22 PerCP-eFluor710抗体 | eBioscience | -- | |
| HSP70抗体 | Enzo Life Science | ADI-SPA-810PE | |
| HSP90抗体 | Enzo Life Science | ADI-SPA-830-488 | |
| 抗兔PE抗体 | Jackson ImmunoReseach | 111-116-144 | |
| 抗鼠FITC二抗 | Beckman Coulter | IM1619 | |
| 生物素标记抗小鼠CD47抗体 | Biolegend | miap301 | |
| APC/Cy7链霉亲和素 | Biolegend | -- | |
| 细胞染色 | SYTOX AADvanced死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | S10349 |
| LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染料 | Molecular Probes, ThermoFisher Scientific | L34957 | |
| DRAQ5 | Alexis Biochemicals | DR50200 | |
| 试剂盒 | ATP检测试剂盒 | Biovision | K354-100 |
| 凋亡检测 | Annexin V/PI染色试剂盒 | Roche | 11 |
| DC培养 | CellGenix GMP DC培养基 | CellGenix GmbH | -- |
| 重组人GM-CSF | PromoKine | -- | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| ELISA | HMGB1 ELISA试剂盒 | IBL International | ST51011 |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EHIL10 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EH2IL1B | |
| IL-1α ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EH2IL1A | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EH2IL6 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | eBioscience | BMS223INSTCE | |
| PGE2 ELISA试剂盒 | Enzo Life Sciences | ADI-930-001 | |
| IFNγ ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EHIFNG | |
| TNFα ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0109 | |
| 流式细胞术 | NF-kB抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc8008 |
| 吞噬实验 | Fast DiA细胞标记液 | Molecular Probes | D7758 |
| DQ-OVA | Molecular Probes | D12053 | |
| 细胞毒性实验 | 钙黄绿素-AM | Invitrogen | -- |
| Hank's平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| HLA-A2特异性单抗cr11.351 | -- | -- | |
| RNA-seq | TruSeq链式总RNA样品制备试剂盒 | Illumina Inc. | -- |
| HiSeq2500平台 | Illumina Inc. | -- | |
| DC分选 | 抗CD14包被微珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 |
| T细胞分选 | MACS微珠 | Miltenyi Biotec | -- |
| 流式细胞术 | Cytofix/Cytoperm溶液 | BD Biosciences | -- |
| eBioscience FoxP3染色缓冲液套装 | eBioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：Mino, SP53, Granta 519 (MCL), DOHH2 (DLBCL), T2-A2, EBV-LCL, A20；培养基：RPMI 1640或DMEM，10% FCS，100 μg/mL链霉素，100 IU/mL青霉素；培养条件：37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines |
| 药物处理 | RA/IFNα浓度：1000 U/ml IFN-α（人）或重组小鼠IFNα，1 μmol/L 9-cis-RA；处理时间：5天（凋亡诱导），48小时（ICD标志物检测），72小时（HMGB1释放）；对照：未处理或γ-辐射 阅读提示：Materials and Methods: Antibodies and reagents, Results: RA/IFNα combination induces ICD |
| TCL制备 | 细胞数：5×10^6细胞/100μl PBS；冻融循环：3次快速冻融；离心：13,000 rpm，15分钟，4°C；蛋白浓度：1 mg/ml 阅读提示：Materials and Methods: TCL preparation and Western blot |
| DC生成和脉冲 | IFN-DC来源：健康供者PBMC；单核细胞分离：CD14微珠；培养：3天，GM-CSF（50 ng/ml）和IFN-α（10,000 U/ml）；TCL负载：100 μg TCL/10^6 DC 阅读提示：Materials and Methods: DC and CTL generation |
| 体外CTL诱导 | 共培养：DC与自体T细胞共培养；再刺激：每周4次；杀伤检测：calcein-AM释放；E:T比例：肿瘤细胞系10:1，肽特异性20:1；肽库：5个cyclin D1肽（HLA-A*0201），3个survivin肽（HLA-B*0801） 阅读提示：Materials and Methods: Cytotoxicity assay, Results: DCs loaded with RA/IFNα-treated TCLs |
| 体内实验 | 小鼠品系：NOD/SCID；年龄：3-4周；每笼4-5只；接种：皮下注射5×10^6 Mino细胞（治疗模型）或腹腔注射PBL（30-40×10^6）；疫苗剂量：2×10^6 DC负载200 μg TCL，腹腔注射；时间表：第0、7、14天 阅读提示：Materials and Methods: Immunization of hu-PBL-NOD-scid mice, Therapeutic vaccination |
| 统计 | 统计学方法：Student's t-test（双尾）；数据表示：均值±SD；独立实验重复次数：至少3次（体外） 阅读提示：Figure legends |