肺真菌感染模型建立
建立烟曲霉肺部感染模型,评估ficolins在体内对真菌清除的影响
使用ficolin双敲除小鼠和野生型小鼠,经鼻吸入亚致死剂量(2 × 10^7 conidia)烟曲霉分生孢子,在感染后12-72小时通过CFU法测定肺真菌载量。
Ficolins Promote Fungal Clearance in vivo and Modulate the Inflammatory Cytokine Response in Host Defense against Aspergillus fumigatus.
包含基因敲除小鼠模型、真菌载量测定、MPO ELISA、细胞因子qPCR和ELISA、补体免疫组化和ELISA等多项独立验证。
C57BL/6J背景的ficolin双基因敲除小鼠 烟曲霉临床分离株6871肺部感染小鼠模型 野生型同窝小鼠
小鼠基因型:ficolin A/B双敲除(Fcna-/-b-/-)及野生型同窝对照 感染剂量与途径:2 × 10^7个烟曲霉分生孢子,50 μl PBS鼻腔吸入 检测时间点:感染后24小时 补体激活评估:C3d免疫组化及BALF中C3a ELISA 细胞因子检测:肺组织qPCR和BALF ELISA(IL-1β、IL-6、TNF-α)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立烟曲霉肺部感染模型,评估ficolins在体内对真菌清除的影响
使用ficolin双敲除小鼠和野生型小鼠,经鼻吸入亚致死剂量(2 × 10^7 conidia)烟曲霉分生孢子,在感染后12-72小时通过CFU法测定肺真菌载量。
检测ficolin缺失是否影响炎症细胞向肺部的募集
感染后24小时取肺组织,HE染色观察组织学炎症浸润,并检测肺匀浆中MPO水平以评估中性粒细胞募集。
检测ficolin缺失对烟曲霉感染后肺部促炎细胞因子产生的影响
感染后24小时提取肺组织RNA,通过qPCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达;并收集BALF和血清,通过ELISA检测相应细胞因子蛋白水平。
验证ficolin缺失是否影响烟曲霉感染中的补体激活
感染后24小时取肺组织进行C3d免疫组化染色,并收集BALF通过ELISA检测C3a浓度。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 感染模型 | 沙氏葡萄糖琼脂 | Oxoid | -- |
| 吐温80 | -- | -- | |
| 细胞筛网 | BD Biosciences | -- | |
| 真菌载量测定 | 组织破碎仪 | Qiagen | -- |
| MPO测定 | 小鼠髓过氧化物酶(MPO) ELISA试剂盒 | Hycult Biotech | HK210 |
| 细胞因子基因表达 | RNA稳定保存液 | Applied Biosystems | -- |
| RNA提取 | Maxwell 16组织LEV总RNA纯化试剂盒 | Promega | -- |
| 逆转录 | MuLV逆转录酶 | Applied Biosystems | N808-0018 |
| cDNA定量 | Qubit荧光计 | Invitrogen | -- |
| qPCR | TaqMan探针 | Applied Biosystems | -- |
| Stratagene Mx3005P实时荧光定量PCR系统 | Agilent Technologies | -- | |
| BAL收集 | 22G导管 | BD Biosciences | -- |
| 细胞因子ELISA | Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 免疫组化 | 蛋白酶K | Roche | -- |
| 多克隆山羊抗小鼠C3d抗体 | R&D Systems | AF2655 | |
| 正常山羊IgG对照抗体 | R&D Systems | AB-108-C | |
| BrightVision多聚HRP抗山羊 | Immunologic | -- | |
| NanoZoomer RS切片扫描仪 | Hamamatsu | -- | |
| 补体C3a ELISA | 小鼠C3a ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-MO0337 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | ficolin A/B双敲除(Fcna-/-b-/-)和野生型(WT)同窝对照,雌性,10-12周龄,C57BL/6J背景 阅读提示:Materials and Methods - Mice |
| 真菌感染 | 烟曲霉临床分离株6871,培养于SDA 37°C 4天,收获分生孢子;感染剂量2×10^7 conidia/50 μl PBS,鼻腔吸入 阅读提示:Materials and Methods - Infection |
| 真菌载量测定 | 肺匀浆CFU测定,至少三个稀释度涂板,37°C培养24小时计数 阅读提示:Materials and Methods - Quantification of the Fungal Burden |
| 细胞因子检测 | qPCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α,内参TBP和B2M;ELISA检测BALF和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 阅读提示:Materials and Methods - Cytokine Gene Expression, Cytokine ELISA Assays |
| 补体激活评估 | 肺组织C3d免疫组化;BALF中C3a ELISA 阅读提示:Materials and Methods - Histology and Immunohistochemistry, Complement Component C3a ELISA, Results - Unimpaired Complement Activation |