Ficolins在体内促进真菌清除并调节宿主防御烟曲霉中的炎症细胞因子反应

Ficolins Promote Fungal Clearance in vivo and Modulate the Inflammatory Cytokine Response in Host Defense against Aspergillus fumigatus.

作者信息Ninette Genster, Elisabeth Præstekjær Cramer, Anne Rosbjerg, Katrine Pilely, Jack Bernard Cowland, Peter Garred
PMID27467404
发布时间2016
DOI10.1159/000447714

实验完整度

高

包含基因敲除小鼠模型、真菌载量测定、MPO ELISA、细胞因子qPCR和ELISA、补体免疫组化和ELISA等多项独立验证。

主要模型

C57BL/6J背景的ficolin双基因敲除小鼠 烟曲霉临床分离株6871肺部感染小鼠模型 野生型同窝小鼠

重点核对

小鼠基因型:ficolin A/B双敲除(Fcna-/-b-/-)及野生型同窝对照 感染剂量与途径:2 × 10^7个烟曲霉分生孢子,50 μl PBS鼻腔吸入 检测时间点:感染后24小时 补体激活评估:C3d免疫组化及BALF中C3a ELISA 细胞因子检测:肺组织qPCR和BALF ELISA(IL-1β、IL-6、TNF-α)

摘要

烟曲霉是一种机会性真菌病原体,在免疫功能低下的患者中引起严重的侵袭性感染。先天免疫在防御烟曲霉中起主要作用。Ficolins是一族可溶性模式识别受体,能够激活补体的凝集素途径。先前的体外研究报告ficolins与烟曲霉结合,但其在体内真菌感染的宿主防御中的作用尚不清楚。在本研究中,我们使用ficolin缺陷小鼠来研究ficolins在烟曲霉肺部感染期间的作用。与野生型小鼠相比,Ficolin基因敲除小鼠在感染后24小时肺部的真菌载量显著更高。在ficolin基因敲除小鼠中烟曲霉清除延迟不能归因于炎症细胞募集的受损。然而,研究发现,与野生型小鼠相比,ficolin基因敲除小鼠在烟曲霉感染后肺部促炎细胞因子的产生减少。ficolin基因敲除小鼠中清除和细胞因子产生的受损与补体无关,这通过ficolin基因敲除小鼠和野生型小鼠中烟曲霉介导的补体激活水平相当来证明。总之,这项研究表明ficolins在体内对烟曲霉感染的初始先天宿主防御中很重要。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
Ficolins在体内对烟曲霉感染宿主防御中的作用是什么?
核心机制
Ficolins通过不依赖补体激活的方式促进烟曲霉分生孢子清除,并调节促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的产生。
主要证据
与野生型小鼠相比,ficolin基因敲除小鼠在感染后24小时肺部真菌载量显著升高,肺组织中IL-1β和IL-6的mRNA表达及BALF中三种促炎细胞因子蛋白水平降低,但肺组织C3d沉积和BALF中C3a水平与野生型无差异。
研究意义
本研究首次证明ficolins在体内参与烟曲霉感染的宿主防御,为理解先天免疫抗真菌机制提供新证据,并提示在免疫受损宿主中可能具有更重要的保护作用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

肺真菌感染模型建立

建立烟曲霉肺部感染模型,评估ficolins在体内对真菌清除的影响

使用ficolin双敲除小鼠和野生型小鼠,经鼻吸入亚致死剂量(2 × 10^7 conidia)烟曲霉分生孢子,在感染后12-72小时通过CFU法测定肺真菌载量。

2

肺部炎症细胞浸润评估

检测ficolin缺失是否影响炎症细胞向肺部的募集

感染后24小时取肺组织,HE染色观察组织学炎症浸润,并检测肺匀浆中MPO水平以评估中性粒细胞募集。

3

促炎细胞因子表达检测

检测ficolin缺失对烟曲霉感染后肺部促炎细胞因子产生的影响

感染后24小时提取肺组织RNA,通过qPCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达;并收集BALF和血清,通过ELISA检测相应细胞因子蛋白水平。

4

补体激活评估

验证ficolin缺失是否影响烟曲霉感染中的补体激活

感染后24小时取肺组织进行C3d免疫组化染色,并收集BALF通过ELISA检测C3a浓度。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证免疫效应
数据分析与统计

产品清单

实验环节名称品牌货号
沙氏葡萄糖琼脂Oxoid--
吐温80----
细胞筛网BD Biosciences--
组织破碎仪Qiagen--
小鼠髓过氧化物酶(MPO) ELISA试剂盒Hycult BiotechHK210
RNA稳定保存液Applied Biosystems--
Maxwell 16组织LEV总RNA纯化试剂盒Promega--
MuLV逆转录酶Applied BiosystemsN808-0018
Qubit荧光计Invitrogen--
TaqMan探针Applied Biosystems--
Stratagene Mx3005P实时荧光定量PCR系统Agilent Technologies--
22G导管BD Biosciences--
Quantikine ELISA试剂盒R&D Systems--
蛋白酶KRoche--
多克隆山羊抗小鼠C3d抗体R&D SystemsAF2655
正常山羊IgG对照抗体R&D SystemsAB-108-C
BrightVision多聚HRP抗山羊Immunologic--
NanoZoomer RS切片扫描仪Hamamatsu--
小鼠C3a ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-MO0337

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
小鼠模型
ficolin A/B双敲除(Fcna-/-b-/-)和野生型(WT)同窝对照,雌性,10-12周龄,C57BL/6J背景
阅读提示:Materials and Methods - Mice
真菌感染
烟曲霉临床分离株6871,培养于SDA 37°C 4天,收获分生孢子;感染剂量2×10^7 conidia/50 μl PBS,鼻腔吸入
阅读提示:Materials and Methods - Infection
真菌载量测定
肺匀浆CFU测定,至少三个稀释度涂板,37°C培养24小时计数
阅读提示:Materials and Methods - Quantification of the Fungal Burden
细胞因子检测
qPCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α,内参TBP和B2M;ELISA检测BALF和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α
阅读提示:Materials and Methods - Cytokine Gene Expression, Cytokine ELISA Assays
补体激活评估
肺组织C3d免疫组化;BALF中C3a ELISA
阅读提示:Materials and Methods - Histology and Immunohistochemistry, Complement Component C3a ELISA, Results - Unimpaired Complement Activation