TSCC外泌体的分离与鉴定
验证从CAL27细胞培养上清中分离的颗粒是否为典型外泌体。
采用超滤和exoEasy Maxi Kit提取外泌体，通过透射电镜观察形态，NTA分析粒径，Western blot检测外泌体标志物CD9、CD81、HSP90和TSG101。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
舌鳞状细胞癌外泌体miR-122-5p促进成纤维细胞向炎症性癌症相关成纤维细胞转化
Tongue squamous cell carcinoma exosomal miR-122-5p promotes the conversion from fibroblasts to inflammatory cancer-associated fibroblasts.
实验完整度
高包含外泌体分离鉴定、细胞功能实验（增殖迁移）、体外机制验证（miRNA测序、双荧光素酶报告基因）及临床样本免疫荧光检测，多层级验证。
主要模型
CAL-27舌鳞状细胞癌细胞系 人口腔黏膜成纤维细胞（hOMFs） 15例高分化舌鳞状细胞癌患者肿瘤组织
重点核对
外泌体分离条件与表征参数 hOMFs与外泌体共培养的剂量和时间 miRNA mimics 和 siRNA 的转染效率及浓度 GNPDA1 靶基因验证的双荧光素酶实验 临床样本中 iCAFs 的检测标志物及判读标准
摘要
目的：本研究旨在探讨舌鳞状细胞癌（TSCC）来源的外泌体microRNA（miRNA）是否促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）转化，并阐明其潜在的分子机制。方法：首先，我们从CAL27舌鳞状细胞癌细胞系中分离并表征了外泌体。然后将这些外泌体与人口腔黏膜成纤维细胞（hOMFs）共培养。我们使用Western blotting（WB）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和ELISA评估了炎症性癌症相关成纤维细胞（iCAFs）相关标志物的表达。随后，我们对外泌体进行了miRNA测序，以鉴定表达量最高的前五种miRNA。然后采用WB评估相应的miRNA模拟物中哪一种最有效地促进hOMFs向iCAFs转化。最后，我们通过生物信息学分析预测了所选miRNA的潜在靶基因，并使用双荧光素酶报告基因实验进行了验证。结果：透射电子显微镜下，分离的外泌体呈现典型的杯状形态，具有双膜结构。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示其粒径分布范围为30至150 nm。Western blotting证实外泌体标志物CD9、CD81、HSP90和TSG101阳性表达，而miRNA测序鉴定出高表达的miRNA为miR-21-5p、miR-122-5p、miR-148a-3p、miR-143-3p和let-7i-5p。其中，miR-122-5p对iCAF相关标志物表达水平的变化影响最显著。生物信息学预测结合双荧光素酶报告基因实验证实GNPDA1是miR-122-5p的直接靶标。结论：CAL27-exo可能通过外泌体miR-122-5p靶向葡糖胺-6-磷酸脱氨酶1（GNPDA1）促进hOMFs转化为iCAFs。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TSCC来源的外泌体miRNA是否促进成纤维细胞向CAFs转化及其分子机制是什么？
- 核心机制
- 外泌体miR-122-5p通过靶向GNPDA1，上调α-SMA表达，并可能通过其他靶基因调控FAP和IL-6，从而促进hOMFs向iCAFs转化。
- 主要证据
- 体外实验显示CAL27外泌体及miR-122-5p可上调iCAF标志物FAP、α-SMA、IL-6，促进细胞增殖迁移；双荧光素酶报告基因证实GNPDA1为直接靶点；GNPDA1敲低仅上调α-SMA，而FAP和IL-6下调；临床样本中9/15例高分化TSCC肿瘤组织检出iCAFs。
- 研究意义
- 研究提示靶向miR-122-5p/GNPDA1信号轴可能通过调控CAFs转化抑制TSCC进展，为潜在治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外泌体对hOMFs转化的功能验证
检测CAL27外泌体是否能促进hOMFs向iCAFs转化及其功能变化。
将PKH26标记的外泌体与hOMFs共培养，通过qRT-PCR、Western blot、ELISA检测iCAF标志物（FAP、α-SMA、IL-6），CCK-8和划痕实验检测增殖和迁移。
外泌体miRNA测序及关键miRNA筛选
鉴定CAL27外泌体中高表达的miRNA并筛选促进iCAFs转化的关键分子。
对3个CAL27外泌体样本进行miRNA测序，确定高表达miRNA，然后通过转染miRNA mimics，用Western blot检测iCAF标志物表达，筛选出作用最强的miR-122-5p。
miR-122-5p靶基因预测与验证
预测并验证miR-122-5p的直接靶基因。
利用miRDB和TargetScan 8.0预测靶基因，并与CAL27外泌体处理的hOMFs转录组数据取交集，qRT-PCR和Western blot验证候选基因表达变化，双荧光素酶报告基因实验确认GNPDA1为直接靶标。
GNPDA1功能验证
验证GNPDA1在iCAFs转化中的作用。
通过siRNA敲低GNPDA1，检测iCAF标志物FAP、α-SMA、IL-6的表达变化。
临床样本中iCAFs的检测
验证iCAFs在临床高分化TSCC组织中的存在。
对15例高分化TSCC患者的肿瘤组织进行多重免疫荧光染色，检测FAP、α-SMA、IL-6等标志物，评估iCAFs的存在。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | VivaCell | -- |
| 胎牛血清 | VivaCell | -- | |
| 无外泌体胎牛血清 | VivaCell | -- | |
| 外泌体提取 | exoEasy Maxi Kit | QIAGEN | -- |
| 外泌体分离 | 3 kDa超滤管 | Millipore | -- |
| 外泌体鉴定 | 透射电子显微镜 | -- | JEM-1400Flash |
| Zetaview PMX110 | Particle Metrix | -- | |
| 外泌体追踪 | PKH26 | -- | -- |
| 共聚焦成像 | 共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blot | CD9抗体 | Abcam | ab263019 |
| CD81抗体 | Abcam | ab79559 | |
| TSG101抗体 | Abcam | ab125011 | |
| FAP抗体 | Abcam | ab207178 | |
| IL-6抗体 | Abcam | ab9324 | |
| HSP90抗体 | OriGene Technologies | TA500494 | |
| GAPDH抗体 | ZEN-BIOSCIENCE | 380646 | |
| α-SMA抗体 | Bioss Antibodies | bsm-33178M | |
| β-tubulin抗体 | Abmart | M20005 | |
| GNPDA1抗体 | Proteintech | 12312-1-AP | |
| 一抗稀释液 | Beyotime | P0273 | |
| 二抗 | ZSGB-BIO | -- | |
| RNA提取 | TaKaRa MiniBEST Universal RNA提取试剂盒 | Takara | -- |
| 反转录 | PrimeScript RT预混液 | Takara | -- |
| qRT-PCR | TB Green Premix Ex Taq II | Takara | -- |
| QuantStudio实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| miRNA提取 | miRcute miRNA提取试剂盒 | TIANGEN Biotech | -- |
| miRNA反转录 | Mir-X miRNA第一链合成试剂盒 | Takara | -- |
| miRNA qPCR | miRcute Plus miRNA qPCR试剂盒 | TIANGEN Biotech | -- |
| 药物处理 | 转化生长因子-β1 | Peprotech | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒8 | GLPbio | -- |
| 酶标仪 | Thermo | -- | |
| 迁移实验 | 细胞培养插入插件 | Ibidi | -- |
| 倒置显微镜 | Olympus | CKX53 | |
| miRNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 转染 | RiboFECT CP转染试剂 | RiboBio | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告 | Promega双荧光素酶系统 | Promega | -- |
| 免疫荧光 | Opal多色免疫荧光试剂盒 | AKOYA Biosciences | -- |
| 荧光显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | CAL-27和hOMF的培养条件、代数、外泌体处理浓度（50 μg/mL）及时间点 阅读提示：Methods: Culture of TSCC Cell Line and hOMFs |
| 外泌体分离与表征 | 外泌体的分离方法、超滤管规格、离心条件、检测的粒径范围及标志物 阅读提示：Methods: Acquisition and identification of TSCC-derived exosomes |
| miRNA mimics转染 | miRNA mimics序列、浓度、转染试剂及转染效率验证 阅读提示：Methods: RNA interference; Table 2 |
| GNPDA1敲低 | siRNA序列、浓度、转染试剂及敲低效率验证 阅读提示：Methods: RNA interference; Table 3 |
| 双荧光素酶报告实验 | 载体构建（psiCheck2）、突变位点、共转染试剂及检测时间 阅读提示：Methods: Luciferase miRNA target reporter assay |
| 临床样本检测 | 患者样本数量、分化程度、组织来源、免疫荧光标志物及判读标准 阅读提示：Results: iCAFs may exist in well-differentiated TSCC; Figure 6 |