与志贺氏菌效应蛋白IcsB相关的细菌脂肪酸酰基转移酶家族

A bacterial family of fatty acid acyltransferases related to the Shigella effector IcsB.

作者信息Waad Bajunaid, Kyle Tomaro, Anwer Hasil Kottarampatel, Geneviève F Desrochers, Mathieu Lavallée-Adam, John P Pezacki, François-Xavier Campbell-Valois
PMID41841725
期刊mBio
发布时间2026-04-08
DOI10.1128/mbio.03890-25

实验完整度

研究包括序列分析、结构预测、酵母毒性实验、凝胶内酰基转移酶活性检测、质谱鉴定底物,以及突变分析,证据层级多样并包含功能验证。

主要模型

酿酒酵母 IcsB及其同源物表达质粒

重点核对

使用的酵母菌株为BY4741(BY4742),培养基为SD加2%半乳糖或葡萄糖 蛋白表达使用GAL1启动子,诱导条件为2%半乳糖处理2小时,后加10 μM脂肪酸炔烃处理4小时 毒性实验中,酵母细胞稀释浓度和1/1000稀释度下的生长抑制 催化残基突变体(H145A, D195A, C306A)对酵母生长和酰基转移酶活性的影响 质谱分析中,使用脂肪酸炔烃标记和生物素点击化学富集酰化蛋白

摘要

Nε-赖氨酸-蛋白脂肪酸酰基转移酶(k-FAT)是在表达含有Rho相互作用结构域(RID)的MARTX毒素或III型分泌系统(T3SS)的细菌中发现的一类新酶。原型k-FAT是T3SS效应蛋白IcsB,它使肠致病性志贺氏菌能够逃避宿主细胞自噬的破坏。我们使用IcsB的酰基转移酶结构域挖掘蛋白质数据库以扩展该家族。除了已知的来自鼻疽伯克霍尔德菌的BopA同源物外,我们在β-和γ-变形菌中还鉴定出几个额外的IcsB样k-FAT。这些新蛋白特征较少,主要存在于含有T3SS的细菌中。尽管序列多样性高,结构预测表明催化残基的空间排布高度保守。此外,酵母细胞毒性及凝胶内酰基转移酶活性依赖于催化位点的完整性,这支持了大多数鉴定的IcsB同源物也是酰基转移酶的观点。最后,我们使用质谱法鉴定了七种新型酶酰化的酵母蛋白。这些蛋白与IcsB共享多种底物,包括膜和囊泡相关蛋白,如SNARE和Rho、Rab及Ras家族的小GTP酶。总的来说,这项研究提供了与IcsB相关的k-FAT家族的证据。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
是否存在与IcsB相关的k-FAT家族,它们是否具有酰基转移酶活性?
核心机制
IcsB样k-FAT家族通过保守的催化三联体(Cys-His-Asp)催化Nε-赖氨酸脂肪酸酰化,主要靶向膜运输相关蛋白,如SNARE和小GTP酶。
主要证据
通过序列相似性搜索和结构预测鉴定了20个同源物,酵母毒性实验和凝胶内酰基转移酶活性检测表明七个同源物具有活性,质谱鉴定了多种底物,且突变分析证实催化位点对活性至关重要。
研究意义
研究扩展了IcsB样k-FAT家族,并提出了基于酵母的检测方法,为研究该家族功能及其在细菌感染中的作用提供了基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

序列和结构分析

鉴定IcsB样k-FAT同源物并分析其保守性

使用PSI-BLAST搜索非冗余蛋白数据库,构建系统发育树,预测蛋白结构并计算RMSD。

2

酵母毒性检测

检测同源物表达是否对酵母有毒性

将IcsB及同源物克隆到GAL1启动子质粒,在含半乳糖的培养基中诱导表达,观察酵母生长抑制。

3

酰基转移酶活性检测

检测同源物是否能将脂肪酸转移到蛋白上

使用脂肪酸炔烃(如17-十八碳炔酸)和点击化学标记,通过凝胶内荧光检测酰化蛋白。

4

催化残基突变分析

验证催化残基对毒性和酰基转移酶活性的必要性

引入催化三联体突变(H145A、D195A、C306A),检测酵母生长和酰基转移酶活性。

5

质谱鉴定底物

鉴定新颖k-FAT的酵母蛋白底物

使用脂肪酸炔烃和生物素点击化学标记酰化蛋白,富集后通过质谱鉴定。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗FLAG抗体Sigma-AldrichF3165
抗GAPDH抗体Bioss antibodiesBS-8789R
HRP标记的山羊抗小鼠IgGJackson Immunoresearch Laboratories Inc.115-035-003
HRP标记的山羊抗兔IgGJackson Immunoresearch Laboratories Inc.111-035-003
Clarity Western ECL底物Bio-Rad1705061
17-十八碳炔酸Cayman Chemical90270
肉豆蔻酸炔烃Cayman Chemical13267
棕榈酸炔烃Cayman Chemical13266
油酸炔烃Cayman Chemical9002078
链霉亲和素琼脂糖珠Thermo Scientific20353
生物离心柱Bio-Rad7326204
胰蛋白酶PromegaV5113
Orbitrap Fusion质谱仪Thermo Scientific--
酵母裂解酶----
醋酸锂Sigma-AldrichL6883
聚乙二醇3350----
鲑鱼精DNA----
营养缺陷型补充物Sigma-AldrichY1751

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
酵母毒性实验
酵母菌株(BY4741)、质粒构建、诱导条件(2%半乳糖)、稀释系列(1/10, 1/100, 1/1000)
阅读提示:Methods: Yeast cytotoxicity assay 部分
酰基转移酶活性检测
脂肪酸炔烃种类和浓度(10 μM)、处理时间(最后4小时)、裂解和标记方法
阅读提示:Methods: In-gel fluorescence acylation assay 部分
质谱鉴定底物
标记试剂(生物素叠氮)、点击化学条件、富集步骤、质谱参数、数据分析流程
阅读提示:Methods: Preparation of the protein samples for mass spectrometry 和 Mass spectrometry data analyses 部分
催化残基突变分析
突变位点(H145、D195、C306)、突变体构建和验证
阅读提示:Methods: Plasmids 部分和图3