序列和结构分析
鉴定IcsB样k-FAT同源物并分析其保守性
使用PSI-BLAST搜索非冗余蛋白数据库,构建系统发育树,预测蛋白结构并计算RMSD。
A bacterial family of fatty acid acyltransferases related to the Shigella effector IcsB.
研究包括序列分析、结构预测、酵母毒性实验、凝胶内酰基转移酶活性检测、质谱鉴定底物,以及突变分析,证据层级多样并包含功能验证。
酿酒酵母 IcsB及其同源物表达质粒
使用的酵母菌株为BY4741(BY4742),培养基为SD加2%半乳糖或葡萄糖 蛋白表达使用GAL1启动子,诱导条件为2%半乳糖处理2小时,后加10 μM脂肪酸炔烃处理4小时 毒性实验中,酵母细胞稀释浓度和1/1000稀释度下的生长抑制 催化残基突变体(H145A, D195A, C306A)对酵母生长和酰基转移酶活性的影响 质谱分析中,使用脂肪酸炔烃标记和生物素点击化学富集酰化蛋白
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定IcsB样k-FAT同源物并分析其保守性
使用PSI-BLAST搜索非冗余蛋白数据库,构建系统发育树,预测蛋白结构并计算RMSD。
检测同源物表达是否对酵母有毒性
将IcsB及同源物克隆到GAL1启动子质粒,在含半乳糖的培养基中诱导表达,观察酵母生长抑制。
检测同源物是否能将脂肪酸转移到蛋白上
使用脂肪酸炔烃(如17-十八碳炔酸)和点击化学标记,通过凝胶内荧光检测酰化蛋白。
验证催化残基对毒性和酰基转移酶活性的必要性
引入催化三联体突变(H145A、D195A、C306A),检测酵母生长和酰基转移酶活性。
鉴定新颖k-FAT的酵母蛋白底物
使用脂肪酸炔烃和生物素点击化学标记酰化蛋白,富集后通过质谱鉴定。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 |
| 抗GAPDH抗体 | Bioss antibodies | BS-8789R | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705061 | |
| 凝胶内酰化 | 17-十八碳炔酸 | Cayman Chemical | 90270 |
| 肉豆蔻酸炔烃 | Cayman Chemical | 13267 | |
| 棕榈酸炔烃 | Cayman Chemical | 13266 | |
| 油酸炔烃 | Cayman Chemical | 9002078 | |
| 质谱样品制备 | 链霉亲和素琼脂糖珠 | Thermo Scientific | 20353 |
| 生物离心柱 | Bio-Rad | 7326204 | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V5113 | |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 酵母培养 | 酵母裂解酶 | -- | -- |
| 醋酸锂 | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| 聚乙二醇3350 | -- | -- | |
| 鲑鱼精DNA | -- | -- | |
| 营养缺陷型补充物 | Sigma-Aldrich | Y1751 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 酵母毒性实验 | 酵母菌株(BY4741)、质粒构建、诱导条件(2%半乳糖)、稀释系列(1/10, 1/100, 1/1000) 阅读提示:Methods: Yeast cytotoxicity assay 部分 |
| 酰基转移酶活性检测 | 脂肪酸炔烃种类和浓度(10 μM)、处理时间(最后4小时)、裂解和标记方法 阅读提示:Methods: In-gel fluorescence acylation assay 部分 |
| 质谱鉴定底物 | 标记试剂(生物素叠氮)、点击化学条件、富集步骤、质谱参数、数据分析流程 阅读提示:Methods: Preparation of the protein samples for mass spectrometry 和 Mass spectrometry data analyses 部分 |
| 催化残基突变分析 | 突变位点(H145、D195、C306)、突变体构建和验证 阅读提示:Methods: Plasmids 部分和图3 |