ADSCs分离与鉴定
建立研究PDGFD功能的体外细胞模型，并确认其干细胞特性。
从哈萨克羊胎儿（约E75）尾部脂肪组织分离ADSCs，培养至P5，通过免疫荧光检测CD44等表面标志物，并诱导成骨和成脂分化，用茜素红S和油红O染色验证分化能力。
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PDGFD通过抑制CXCL8并激活PI3K/MAPK信号通路维持绵羊尾部ADSCs的增殖状态
PDGFD maintains ovine tail ADSCs in a proliferative state by suppressing CXCL8 and activating PI3K/MAPK signaling.
实验完整度
中包含ADSCs分离鉴定、siRNA敲降、CCK-8增殖检测、RNA-seq转录组及RT-qPCR验证，但缺乏动物模型和体内功能验证。
主要模型
绵羊胎儿尾部脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）
重点核对
ADSCs来源于哈萨克羊约E75胎儿尾部脂肪组织 使用si-PDGFD-1427敲降PDGFD，浓度20 nM，转染24或48小时 CCK-8增殖检测在24、48、72小时进行，每组5个重复 RNA-seq每个时间点和组别3个生物学重复 RT-qPCR验证基因表达，内参为GAPDH
摘要
Introduction: The fat tail in sheep is a distinctive adaptive trait, yet the cellular mechanisms controlling its development remain poorly understood. Although PDGFD is a high-priority candidate gene from selective sweep analyses, its precise cellular function and underlying molecular mechanisms are uncharacterized.Methods: We first defined E70-E80 as the critical fetal period for the initial formation of rump or tail adipose tissue in sheep. To delineate the functional role of PDGFD, we performed knockdown experiments in ovine adipose-derived stem cells (ADSCs) and conducted transcriptomic profiling.Results: PDGFD knockdown significantly inhibited ADSCs proliferation and concurrently upregulated key adipogenic markers (PPARγ, FABP4). Transcriptomics revealed that this phenotype was mediated primarily through the profound downregulation of the chemokine CXCL8. Pathway analysis demonstrated that the PDGFD-CXCL8 axis co-regulates adipose plasticity by modulating both the PI3K-Akt and MAPK signaling pathways.Conclusion: We conclude that PDGFD is a master regulator of adipose tissue plasticity, driving progenitor expansion via a CXCL8-dependent mechanism. This PDGFD-CXCL8 regulatory axis orchestrates the cellular groundwork essential for the extensive fat deposition that defines the ovine fat-tail phenotype.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PDGFD在绵羊尾部脂肪组织发育中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- PDGFD通过维持CXCL8表达，激活PI3K-Akt和MAPK信号通路，从而促进ADSCs增殖并抑制其成脂分化。
- 主要证据
- 在绵羊胎儿尾部ADSCs中敲降PDGFD后，CCK-8实验显示细胞增殖显著受抑，RT-qPCR显示PPARγ和FABP4显著上调；RNA-seq显示CXCL8显著下调，KEGG富集和PPI分析表明与PI3K-Akt和MAPK通路相关。
- 研究意义
- 该研究为理解绵羊肥尾性状的发育基础提供了分子机制，并提示PDGFD-CXCL8轴可能作为调控脂肪组织可塑性的关键枢纽。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PDGFD敲降模型建立
通过siRNA敲降PDGFD，检测敲降效率并观察细胞形态变化。
设计并合成三种siRNA（si-1427、si-3136、si-1619）和阴性对照，转染至ADSCs，转染后24小时通过RT-qPCR评估敲降效率，并观察细胞形态变化。
细胞增殖检测
评估PDGFD敲降对ADSCs增殖能力的影响。
使用CCK-8试剂盒在转染后24、48、72小时检测细胞活力，比较si-PDGFD组和siNC组的OD450值。
转录组测序与生物信息学分析
揭示PDGFD敲降后全基因组转录变化，并识别关键下游信号通路。
提取si-PDGFD和siNC转染后48小时的ADSCs总RNA，进行RNA-seq，分析差异表达基因，进行GO、KEGG富集和GSEA分析，并构建PPI网络。
RT-qPCR验证
验证RNA-seq结果中关键基因的表达变化。
使用与测序相同的RNA样本，在转染后24和48小时对关键基因（如CXCL8、PPARγ、FABP4等）进行RT-qPCR检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织采集 | 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | -- |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | -- | |
| 细胞培养 | 0.25%胰蛋白酶 | TransGen Biotech | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 牛血清白蛋白 | Bioss | -- | |
| CD44抗体 | Bioss | bs-55039R | |
| CoraLite488标记的山羊抗兔IgG | Wuhan Sanying | SA00013-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 成脂诱导 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 罗格列酮 | -- | -- | |
| IBMX | -- | -- | |
| 成脂染色 | 油红O溶液 | Beyotime | -- |
| 成骨诱导 | 抗坏血酸 | -- | -- |
| β-甘油磷酸 | -- | -- | |
| 成骨染色 | 茜素红S溶液 | BBI Life Sciences | -- |
| siRNA转染 | siRNA寡核苷酸 | BBI Life Sciences | -- |
| EL转染试剂 | BBI Life Sciences | -- | |
| Opti-MEM培养基 | BBI Life Sciences | -- | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | TransZol Up试剂 | TransGen Biotech | -- |
| EasyScript一步法gDNA去除和cDNA合成预混液 | TransGen Biotech | -- | |
| RT-qPCR | ArtiCanCEO SYBR qPCR预混液 | Tsingke | -- |
| LightCycler 96 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ADSCs分离与培养 | 胎儿日龄约E75，组织来源为哈萨克羊尾部脂肪；细胞传代至P5；培养条件为37°C、5% CO2 阅读提示：见2.1和2.2节 |
| PDGFD敲降 | siRNA序列（si-1427等）详见补充表S3；转染浓度20 nM；细胞密度60%-70% 阅读提示：见2.6节和补充表S3 |
| 细胞增殖检测 | 细胞密度2.0×10^4细胞/孔；检测时间点24、48、72小时；CCK-8溶液10%；5个重复 阅读提示：见2.6节和图4c |
| RNA-seq | 转染后48小时；3个生物学重复；差异基因筛选标准FDR<0.05，|log2FC|>1 阅读提示：见2.7节 |
| RT-qPCR验证 | 使用与测序相同的RNA样本；内参基因GAPDH 阅读提示：见2.9.3节 |