葫芦巴水醇提取物在胰岛素抵抗L6肌管体外模型中影响胰岛素信号通路

Hydroalcoholic Extracts of Cucumis prophetarum L. Affect the Insulin Signaling Pathway in an In Vitro Model of Insulin-Resistant L6 Myotubes.

作者信息Zewdie Mekonnen, Giuseppe Petito, Getasew Shitaye, Gianluca D'Abrosca, Belete Adefris Legesse, Sisay Addisu, Antonia Lanni, Roberto Fattorusso, Carla Isernia, Lara Comune, Simona Piccolella, Severina Pacifico, Rosalba Senese, Gaetano Malgieri, Solomon Tebeje Gizaw
PMID41599356
期刊Molecules
发布时间2026-01-15
DOI10.3390/molecules31020307

实验完整度

高

包含光谱与质谱代谢物分析、体外细胞活力与脂质染色、Western blot信号通路与GLUT4转位验证,多层级证据。

主要模型

胰岛素抵抗L6肌管细胞(棕榈酸诱导)

重点核对

L6肌管分化条件 棕榈酸浓度750 μM及处理时间18小时 提取物处理浓度为300 μg/mL,处理6小时 蛋白磷酸化检测位点(IRS-1 Tyr612/Ser307,Akt Ser473等) GLUT4膜转位检测

摘要

2型糖尿病(T2DM)可由富含黄酮和三萜类化合物的食用和药用物种传统治疗,这些化合物以其代谢益处而闻名。葫芦巴(Cucumis prophetarum L.)的煎剂提取物已显示出抗氧化和抗糖尿病特性。由于溶剂极性强烈影响次生代谢物的提取,本研究探讨了葫芦巴的水醇提取物,以探索其化学成分和胰岛素增敏潜力。通过紫外-可见光谱、ATR-FTIR和UHPLC-ESI-QqTOF-MS/MS分析了葫芦巴叶、茎和根的水醇提取物,以描绘其次生代谢物谱。使用棕榈酸诱导的L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗体外模型评估每种提取物的胰岛素增敏潜力,随后通过Western blot分析关键胰岛素信号蛋白。叶和茎提取物中富含芹菜素-C,O-二己糖苷、芹菜素-丙二酰己糖苷和木犀草素-C,O-二己糖苷等黄酮苷,而根中则以葫芦素为主。MTT实验证实,葫芦巴水醇茎和根提取物对L6肌管无细胞毒性,而叶提取物仅在高浓度时降低细胞活力。油红O染色显示,茎和根提取物处理后脂质积累显著减少。一致地,茎提取物通过激活IRS-1/PI3K/Akt通路增强胰岛素信号,而根提取物主要调节AMPK-mTOR通路。重要的是,两种提取物均促进GLUT4转位至质膜,突显了它们在恢复胰岛素敏感性方面的互补机制。葫芦巴水醇提取物通过多种分子机制减轻胰岛素抵抗,其生物活性和组成与先前报道的煎剂显著不同,这突显了它们作为胰岛素增敏植物化学物质的有前景来源,并强调了溶剂选择在最大化治疗潜力中的重要性。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
葫芦巴水醇提取物是否具有改善胰岛素抵抗的潜力,其化学成分和机制与煎剂有何不同?
核心机制
茎提取物通过激活IRS-1/PI3K/Akt通路,根提取物主要通过调制AMPK-mTOR通路,共同促进GLUT4转位,恢复胰岛素敏感性。
主要证据
在棕榈酸诱导的胰岛素抵抗L6肌管中,茎提取物提高IRS-1 Tyr612、Akt、GSK3β磷酸化,降低IRS-1 Ser307和mTOR磷酸化;根提取物提高AMPKα磷酸化,降低mTOR磷酸化;两者均增加GLUT4膜定位。
研究意义
本研究强调溶剂选择对植物提取物生物活性的重要性,并提示葫芦巴水醇提取物作为胰岛素增敏植物化学物质来源的潜力,为后续体内研究提供基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

制备水醇提取物

获取葫芦巴叶、茎和根的水醇提取物,用于后续分析

植物材料采自埃塞俄比亚,经干燥、粉碎后,用甲醇/水(4:1)在室温下浸渍72小时,过滤、浓缩、冻干。

2

代谢物谱分析

鉴定各提取物的次生代谢物组成

采用UV-Vis光谱、ATR-FTIR和UHPLC-ESI-QqTOF-MS/MS分析提取物。

3

细胞活力测定

评估提取物对L6肌管的细胞毒性

L6细胞分化后,用不同浓度(100-500 μg/mL)的提取物处理24小时,MTT法检测活力。

4

建立胰岛素抵抗模型并处理

诱导胰岛素抵抗并测试提取物的改善作用

L6肌管用750 μM棕榈酸处理18小时,然后加入300 μg/mL提取物继续处理6小时。

5

脂质积累检测

评估提取物对脂质积累的影响

油红O染色定量脂质积累,用异丙醇溶解后测定吸光度,规范化至总蛋白含量。

6

Western blot分析信号通路

检测胰岛素信号通路关键蛋白磷酸化水平

提取总蛋白和膜蛋白,SDS-PAGE分离,转膜,用特异性抗体检测P-IRS1、P-AKT、P-GSK3β、P-AMPKα、P-mTOR和GLUT4。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Heidolph Hei-VAP Advantage 旋转蒸发仪Heidolph--
Biocool FD-1A-50 冻干机Biocool--
Mobi™ 原子吸收酶标仪MSE Supplies--
IRXross 傅里叶变换红外光谱仪Shimadzu--
岛津NEXERA超高效液相色谱系统Shimadzu--
Luna® Omega C18 色谱柱Phenomenex1.6
AB Sciex TripleTOF® 4600 质谱仪AB Sciex--
杜氏改良Eagle培养基----
胎牛血清----
青霉素----
链霉素----
棕榈酸Merck--
MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)Merck57360-69-7
Sinergy H1 酶标仪BioTek--
RIPA裂解缓冲液----
PhosSTOP™ 磷酸酶抑制剂Roche--
DC蛋白定量试剂盒Bio-Rad--
Precision Plus Protein™ 全蓝预染蛋白标准品Bio-Rad1610373
抗磷酸化IRS1 (Tyr612)抗体Invitrogen--
抗磷酸化IRS1 (Ser307)抗体Millipore--
抗IRS1抗体Cell Signaling--
抗磷酸化AKT (Ser473)抗体Cell Signaling--
抗AKT抗体Cell Signaling--
抗磷酸化GSK3β (Ser9)抗体ABclonal--
抗GSK3β抗体ABclonal--
抗磷酸化AMPKα (Thr172)抗体Cell Signaling--
抗AMPKα抗体Cell Signaling--
抗磷酸化mTOR (Ser2448)抗体Cell Signaling--
抗mTOR抗体Cell Signaling--
抗GLUT4抗体Cell Signaling--
抗β-肌动蛋白抗体Bioss--
辣根过氧化物酶标记抗兔IgGabcam--
辣根过氧化物酶标记抗鼠IgGabcam--
ChemiDoc XRS+ 化学发光成像系统Bio-Rad--
TGX Stain-Free 凝胶Bio-Rad--
尼康Eclipse TE300光学显微镜Nikon--
miRNeasy Mini 试剂盒Qiagen--
NanoDrop 2000c 分光光度计Thermo Scientific--
SuperScript II 逆转录酶试剂盒Thermo Scientific--
SensiFAST SYBR Hi-ROX 预混液Meridian Bioscience--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与处理
L6细胞培养条件(DMEM+10%FBS,37°C,5% CO2),分化条件(2%FBS),棕榈酸浓度750 μM,提取物浓度300 μg/mL,处理时间
阅读提示:见Materials and Methods 4.4和4.5
代谢物分析
色谱柱规格、流动相梯度、质谱参数(源温度、电压、碰撞能量)
阅读提示:见Materials and Methods 4.3
蛋白磷酸化检测
抗体货号及稀释度,蛋白上样量,内参选择(β-actin或Stain-Free),膜制备方法
阅读提示:见Materials and Methods 4.6
脂质积累检测
油红O染色步骤,定量方法(吸光度与蛋白归一化)
阅读提示:见Materials and Methods 4.7