hDPSCs的分离与特征鉴定
验证分离的细胞具有间充质干细胞特性和多向分化潜能。
从健康牙齿牙髓组织分离细胞，通过STRO-1 MACS分选富集，并通过免疫荧光检测CD44、STRO-1、Nestin表达，以及通过成脂、成软骨、成骨和成牙本质分化诱导和染色验证分化能力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
两种水硬性硅酸钙水门汀刺激人牙髓干细胞中S100A基因的差异表达：一项实验室研究。
Differential Expression of S100A Genes in hDPSCs Following Stimulation with Two Hydraulic Calcium Silicate Cements: A Laboratory Investigation.
实验完整度
高包含细胞鉴定、细胞活力、炎症反应、分化与矿化功能实验及13个S100A基因表达谱分析等多个证据层级
主要模型
人牙髓干细胞（hDPSCs） STRO-1阳性细胞经MACS分选
重点核对
HCSC条件培养基浓度（0.002、0.02、0.2 mg/mL） 细胞来源（9-12岁患者健康未完成根形成牙齿） 刺激时间（24h和72h） 对照组（未刺激细胞、地塞米松和IL-1β刺激组） qPCR基因列表（13个S100A基因、IL6、IL8、DSPP、ALP）
摘要
水硬性硅酸钙水门汀（HCSCs）是活髓治疗（VPT）和再生性牙髓治疗（RET）中的现代材料，因为其对牙髓和牙周细胞具有有利影响，包括细胞分化和硬组织形成。最近的研究还表明几种S100A蛋白参与牙髓的炎症、分化和矿化过程。本研究的目的是探讨HCSCs对人牙髓干细胞（hDPSCs）中S100A基因表达的影响。分离人牙髓干细胞，并通过多向分化干细胞标志物和分化方案进行鉴定。在刺激实验中，hDPSCs暴露于ProRoot®MTA、Biodentine®、IL-1β和地塞米松。通过XTT法测定细胞活力。测量IL-6和IL-8 mRNA表达以分析促炎反应。此外，进行了成牙本质细胞分化和生物矿化测定（DSPP和ALP mRNA表达、ALP活性和茜素红染色）。使用qPCR检测13个S100A基因的差异表达。低浓度的HCSCs增强了hDPSCs的增殖，而较高浓度表现出细胞毒性作用。HCSCs诱导促炎反应并导致成牙本质细胞分化和生物矿化。这伴随着各种S100A基因表达水平的显著改变。ProRoot®MTA和Biodentine®显著影响hDPSCs中多个S100A基因的表达，支持它们在炎症、分化和矿化中的作用。这些发现表明HCSCs在VPT或RET期间对人牙髓细胞的影响与S100A蛋白之间存在联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ProRoot®MTA和Biodentine®是否影响人牙髓干细胞（hDPSCs）的S100A基因表达、矿化特性和炎症状态？
- 核心机制
- HCSCs通过激活炎症信号通路（如NF-κB）可能诱导hDPSCs的成牙本质分化和矿化，并伴随多个S100A基因的差异表达，提示S100A蛋白参与HCSCs的细胞效应。
- 主要证据
- 体外实验显示HCSCs低浓度促进细胞增殖，诱导IL-6和IL-8表达，增加ALP活性和茜素红染色，并显著改变多个S100A基因表达（如S100A1、A2、A3、A11、A13、A16）。
- 研究意义
- 研究首次报道HCSCs对hDPSCs中S100A基因表达的差异影响，支持S100A蛋白在VPT和RET相关炎症、分化和矿化过程中的重要性，有助于生物材料的开发与改良。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HCSC条件培养基制备
制备用于刺激hDPSCs的水硬性硅酸钙水门汀提取物。
将ProRoot®MTA和Biodentine®制成直径15mm、厚1.5mm的圆盘，固化后研磨成粉，以20mg/mL溶于DMEM，孵育24小时后离心过滤，得到条件培养基。
细胞活力测定
评估HCSCs条件培养基对hDPSCs活力的影响，确定刺激浓度。
将hDPSCs接种于96孔板，暴露于不同浓度（20,10,2,0.2,0.02,0.002mg/mL）的HCSC条件培养基24小时，通过XTT法检测细胞活力。
炎症反应分析
检测HCSCs刺激后hDPSCs的促炎反应。
将hDPSCs暴露于HCSC条件培养基（0.002,0.02,0.2mg/mL）及IL-1β（10ng/mL）或地塞米松（100nM）24和72小时，通过qPCR检测IL-6和IL-8 mRNA表达。
成牙本质/成骨分化与矿化分析
评估HCSCs对hDPSCs成牙本质/成骨分化和矿化的影响。
在成骨培养基中加入HCSC条件培养基（0.2,0.02,0.002mg/mL）、地塞米松或IL-1β，培养6天（ALP活性）或30天（ARS/CPC），检测ALP活性、ALP和DSPP mRNA表达以及茜素红染色。
S100A基因表达谱分析
检测HCSCs刺激后hDPSCs中13个S100A基因的表达变化。
收集24h和72h刺激后的细胞，提取RNA，逆转录cDNA，通过qPCR检测13个S100A基因（S100A1, -A2, -A3, -A4, -A6, -A7, -A8, -A9, -A10, -A11, -A13, -A14, -A16）的表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco™ | -- |
| 胎牛血清 | Gibco™ | -- | |
| 抗生素和抗真菌溶液 | Gibco™ | -- | |
| 成纤维细胞生长因子-2 | R&D Systems | -- | |
| 细胞分选 | MACS® | Miltenyi Biotec | -- |
| 抗STRO-1抗体 | R&D Systems | -- | |
| 细胞培养 | DAPI | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 山羊血清 | DAKO | -- | |
| 抗CD44抗体 | DAKO | -- | |
| 抗Nestin抗体 | DAKO | -- | |
| 抗Stro-1抗体 | R&D Systems | -- | |
| 抗DSPP抗体 | Bioss | -- | |
| 抗NFκB p65抗体 | Cell Signaling Technologies | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Cy3标记二抗 | Dianova | -- | |
| Alexa Fluor-488标记二抗 | Dianova | -- | |
| Mowiol/DABCO封片剂 | Roth | -- | |
| Axio Imager.A1显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 分化诱导 | 地塞米松 | Sigma-Aldrich | -- |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | -- | |
| L-抗坏血酸2-磷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| β-甘油磷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转化生长因子β3 | R&D Systems | -- | |
| 染色 | 油红O | -- | -- |
| 茜素红S | Sigma-Aldrich | -- | |
| 甲苯胺蓝 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Aquatex®封片剂 | Merck | -- | |
| 免疫荧光染色 | 甲醇 | AppliChem | -- |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白酶K | DAKO | -- | |
| 抗II型胶原一抗 | Acris Antibodies | -- | |
| 材料制备 | ProRoot®MTA | Dentsply Tulsa Dental | -- |
| Biodentine® | Septodont GmbH | -- | |
| Millex®针头式滤器 | EMD Millipore Corporation | -- | |
| 细胞活力测定 | PromoKine XTT检测试剂盒 | Promocell | -- |
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA定量 | NanoDrop ND-1000分光光度计 | NanoDrop Technologies | -- |
| cDNA合成 | iScript™ Select cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 统计 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | 细胞来源（9-12岁患者健康牙）、培养基成分（DMEM+10%FBS+1%抗生素/抗真菌+5ng/mL FGF-2）、MACS分选（抗STRO-1抗体）、培养条件（37°C, 5%CO2）、传代至第9代 阅读提示：见Methods 2.1 |
| HCSC条件培养基制备 | 圆盘尺寸（直径15mm，厚度1.5mm）、固化后研磨成粉、20mg/mL溶于DMEM、孵育24h（37°C, 5%CO2）、离心和过滤（0.45µm） 阅读提示：见Methods 2.4 |
| 细胞活力测定（XTT） | 细胞数（10,000/孔）、浓度范围（20-0.002mg/mL）、处理时间（24h）、检测波长（490nm/670nm）、对照（无添加培养基）、统计学（one-way ANOVA, Dunnett） 阅读提示：见Methods 2.5及Figure 2 |
| 炎症及S100A基因表达分析 | 刺激浓度（0.002,0.02,0.2mg/mL HCSC；IL-1β 10ng/mL；Dexa 100nM）、刺激时间（24h和72h）、细胞代数（P3）、2个供体、三重复、qPCR条件（MIQE指南） 阅读提示：见Methods 2.6和2.7，Results 3.3和3.5，Table 1 |
| 分化与矿化分析 | 成骨培养基成分（0.2mM L-抗坏血酸2-磷酸，10nM β-甘油磷酸）、HCSC浓度（0.2,0.02,0.002mg/mL）、刺激时间（6天ALP，30天ARS）、ALP活性测定波长（562nm）、ARS浓度（40mM, pH4.1）、CPC提取（10% CPC） 阅读提示：见Methods 2.8，Results 3.4，Figure 5 |