构建噬菌体免疫文库
从肺癌患者淋巴组织中获得多样化的全人源scFv抗体库，用于筛选抗Siglec-15抗体。
提取肺癌患者淋巴结RNA，反转录cDNA，PCR扩增VH和VL基因，通过重叠PCR构建VH-Vκ和VH-Vλ基因，克隆至噬菌体载体pCANTAB-5E，转化大肠杆菌TG1，构建scFv噬菌体展示文库。
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用于肿瘤免疫治疗的新型抗Siglec-15抗体的开发
Development of a Novel Anti-Siglec-15 Antibody for Tumor Immunotherapy.
实验完整度
高包含体外细胞实验（ADCC、T细胞增殖、凋亡）、斑马鱼模型和人源化小鼠模型，并进行了功能验证和机制验证（T细胞浸润和激活）。
主要模型
A549细胞系 S15-A549细胞系（A549稳定过表达Siglec-15） 斑马鱼肿瘤模型 PBMC人源化小鼠肿瘤模型
重点核对
抗体对Siglec-15的亲和力（KD值）及特异性（不与EphA2、B7-H3、Trop2、CD24交叉反应） ADCC实验中效应细胞（PBMC）与靶细胞（A549、PC-3、S15-A549）的比例为10:1 T细胞增殖实验中人Siglec-15蛋白浓度（5 μg/mL）和抗体浓度（20 μg/mL） 人源化小鼠模型中抗体给药剂量（15 mg/kg，每三天一次，尾静脉注射）及肿瘤细胞接种量（3×10^6）
摘要
目的
作为癌症免疫治疗的新候选，靶向siglec-15的抗体有望为对程序性死亡配体1（PD-L1）抗体治疗无反应的肿瘤提供替代治疗策略。迄今为止，针对siglec-15的药理学开发尚未取得重大突破或临床批准。因此，本研究旨在开发一种新型抗siglec-15抗体，以恢复肿瘤免疫正常化。
方法
在本研究中，我们利用噬菌体展示技术构建了来源于肺癌患者淋巴组织的噬菌体免疫文库，并从中筛选出针对siglec-15抗原的全人源抗体。通过生物层干涉法检测抗体亲和力，通过流式细胞术检测抗体与siglec-15阳性肿瘤细胞的结合率，并通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）作用反映抗体介导的杀伤细胞对肿瘤细胞的活性。通过T淋巴细胞增殖实验研究抗体对siglec-15抗原引起的增殖抑制的阻断作用，并从肺癌患者来源的恶性胸腔积液标本中收集CD8+ T细胞，以确定抗体是否能减轻肿瘤微环境（TME）中存在的免疫抑制。通过构建斑马鱼肿瘤模型和人源化小鼠肿瘤模型，在体内研究了该抗体的抗肿瘤功效。
结果
该抗体表现出纳摩尔级亲和力和特异性，在体外分析中增强了针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC），逆转了T细胞抑制，并减少了CD8+ T细胞耗竭。体内模型通过增加淋巴细胞浸润和激活证实了肿瘤生长抑制。
结论
来自肺癌患者淋巴组织的抗体免疫文库可以筛选出针对siglec-15靶抗原的特异性抗体，并在体外和体内发挥一定的生物学功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发一种新型抗Siglec-15抗体，通过恢复肿瘤免疫正常化来治疗对PD-L1抗体疗法无反应的肿瘤？
- 核心机制
- 抗Siglec-15抗体通过增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和逆转Siglec-15介导的T细胞抑制，减少CD8+ T细胞耗竭，并促进肿瘤组织中淋巴细胞浸润和激活，从而抑制肿瘤生长。
- 主要证据
- 体外实验显示抗体具有纳摩尔级亲和力，增强ADCC，逆转T细胞增殖抑制，减少CD8+ T细胞凋亡并促进GZMB产生；体内实验（斑马鱼和人源化小鼠模型）显示肿瘤生长抑制，肿瘤组织中人淋巴细胞浸润增加。
- 研究意义
- 本研究为开发靶向Siglec-15的抗体药物和肿瘤免疫正常化治疗提供了理论框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选抗Siglec-15单链抗体
通过噬菌体展示技术富集并筛选能特异性结合Siglec-15抗原的scFv。
使用生物素化的Siglec-15抗原进行液相筛选，加入Dynabeads M-280富集，经过三轮富集后，随机挑选单克隆进行ELISA鉴定，筛选出阳性克隆并测序。
构建和表达全人源IgG1抗体
将筛选出的scFv转换为全人源IgG1抗体，并表达纯化用于功能研究。
将scFv的VH和VL基因克隆到表达载体（CH-pcDNA3.4和Cλ-pcDNA3.4），转染HEK293F细胞，7天后收集上清，通过蛋白A亲和层析纯化抗体。
验证抗体结合活性和特异性
通过ELISA和BLI检测抗体对Siglec-15的亲和力和特异性。
ELISA检测抗体与Siglec-15及多种肿瘤高表达蛋白（EphA2, B7-H3, Trop2, CD24）的结合；BLI测定抗体与生物素化Siglec-15的亲和力。
检测抗体与肿瘤细胞的结合
通过流式细胞术和免疫荧光检测抗体与Siglec-15阳性肿瘤细胞的结合能力。
构建稳定过表达Siglec-15的A549细胞系（S15-A549），使用流式细胞术检测抗体与多种细胞（16-HBE, T24, PC-3, NCI-H157, A549, S15-A549）的结合；免疫荧光检测抗体与PC-3、A549、S15-A549的结合。
评估抗体介导的ADCC效应
评估抗体是否能通过ADCC作用介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞。
以健康人PBMC为效应细胞，A549、PC-3和S15-A549为靶细胞，在有无抗体的条件下共培养，使用CytoTox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒测定细胞毒性。
评估抗体对T细胞增殖抑制的逆转作用
验证抗体是否能阻断Siglec-15抗原介导的T细胞增殖抑制。
使用抗CD3抗体激活健康人PBMC，加入人Siglec-15蛋白（5 μg/mL）和/或抗体（20 μg/mL）共培养72小时，通过流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+ T细胞增殖。
评估抗体对CD8+ T细胞凋亡和功能的影响
利用肺癌患者恶性胸腔积液样本，验证抗体是否能恢复耗竭CD8+ T细胞的功能。
从恶性胸腔积液中分离淋巴细胞，与抗体共培养72小时，通过流式细胞术检测CD8+ T细胞凋亡、IFN-γ和GZMB的产生。
斑马鱼肿瘤模型验证体内抗肿瘤效果
利用斑马鱼肿瘤模型评估抗体能否抑制肿瘤生长。
将Dil标记的A549细胞和Dio标记的PBMC以9:1混合后注射入斑马鱼卵黄囊，每日静脉注射S131-IgG1（1 nL），三天后通过荧光显微镜监测肿瘤荧光强度。
人源化小鼠肿瘤模型验证体内抗肿瘤效果
在PBMC人源化小鼠模型中评估抗体的抗肿瘤效果及其对肿瘤浸润淋巴细胞的影响。
NTG小鼠皮下接种A549细胞（3×10^6），肿瘤体积约80 mm3时尾静脉注射1×10^7健康人PBMC，一周后随机分组（n=6），治疗组每三天尾静脉注射S131-IgG1（15 mg/kg），共两周，监测肿瘤体积和体重，处死后通过流式细胞术分析外周血和肿瘤组织中的免疫细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | NEWZERUM | -- | |
| SMM293-T1培养基 | SinoBiological | -- | |
| 抗体表达 | FreeStyle™ 293-F细胞 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 抗体筛选 | Dynabeads M-280磁珠 | Invitrogen | -- |
| 抗M13抗体（HRP） | SinoBiological | -- | |
| 抗体表达 | SE无缝克隆和组装试剂盒 | Zomanbio | -- |
| 抗体纯化 | 蛋白A亲和层析柱 | GE | -- |
| 亲和力检测 | SA生物传感器 | Pall ForteBio | -- |
| 流式细胞术 | 兔抗人IgG H&L/Alexa Fluor 647抗体 | Bioss | -- |
| 免疫荧光 | 山羊抗人IgG H&L/AF594抗体 | Bioss | -- |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Beyotime | -- | |
| ADCC实验 | Ficoll-Paque PREMIUM分离液 | Cytiva | -- |
| CytoTox 96®非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | -- | |
| T细胞增殖实验 | 抗人CD3抗体 | Biolegend | -- |
| CFSE染料 | Biolegend | -- | |
| 流式细胞术 | FITC抗人CD3抗体 | Biolegend | -- |
| APC/Cyanine7抗人CD8抗体 | Biolegend | -- | |
| APC抗人CD4抗体 | Biolegend | -- | |
| 7-AAD染料 | BD | -- | |
| T细胞功能检测 | Ultra-LEAF™纯化抗人CD3抗体 | Biolegend | -- |
| Ultra-LEAF™纯化抗人CD28抗体 | Biolegend | -- | |
| FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD | -- | |
| PE-Cy7抗人IFN-γ抗体 | BD | -- | |
| PE抗人颗粒酶B抗体 | BD | -- | |
| 斑马鱼模型 | Dio荧光染料 | Beyotime | -- |
| Dil荧光染料 | Servicebio | -- | |
| 小鼠模型 | Miltenyi Biotec肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 流式细胞术 | 抗人CD45-PE抗体 | -- | -- |
| 抗小鼠CD45-PE-Cy7抗体 | -- | -- | |
| 抗人CD3-FITC抗体 | -- | -- | |
| 抗人CD8-APC-Cy7抗体 | -- | -- | |
| LIVE/DEAD™ 7-AAD染料 | -- | -- | |
| LIVE/DEAD™ Zombie Red™染料 | -- | -- | |
| 抗人CD69-BV785抗体 | -- | -- | |
| 抗人GZMB-BV421抗体 | -- | -- | |
| 抗人IFN-γ-PE-Cy7抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基类型、血清浓度、细胞系来源 阅读提示：Materials and Methods中的Cell Lines部分 |
| 抗体筛选 | 抗原浓度、筛选轮数、阳性克隆判定标准（OD值大于阴性对照2.5倍） 阅读提示：Materials and Methods中的Library Construction and Anti-siglec15 Single-Chain Antibody Screening部分 |
| 抗体表达与纯化 | 转染细胞系（HEK293F）、表达载体、纯化方法（蛋白A亲和层析） 阅读提示：Materials and Methods中的Anti-siglec15 IgG1 Antibody Expression, Purification, and Characterization部分 |
| 亲和力与特异性检测 | BLI检测中的抗体浓度（5, 10, 20 μg/mL）、ELISA中抗原包被浓度（1 μg/mL） 阅读提示：Materials and Methods中的Identification of Anti-Siglec-15 Antibody Affinity by Bio-Layer Interferometry和ELISA部分 |
| ADCC实验 | 效应细胞（PBMC）与靶细胞（A549, PC-3, S15-A549）的比例（10:1） 阅读提示：Materials and Methods中的ADCC Activity部分 |
| T细胞增殖实验 | Siglec-15蛋白浓度（5 μg/mL）、抗体浓度（20 μg/mL）、培养时间（72小时） 阅读提示：Materials and Methods中的Lymphocyte Proliferation部分 |
| T细胞凋亡与功能检测 | 抗体浓度（20 μg/mL）、培养时间（72小时）、胸腔积液样本数（≥6） 阅读提示：Materials and Methods中的Detection of T Lymphocyte Apoptosis and Activity部分 |
| 斑马鱼模型 | 注射细胞数（200-400个）、细胞比例（A549:PBMC = 9:1）、注射剂量（1 nL/天） 阅读提示：Materials and Methods中的Zebrafish Tumor Model部分 |
| 人源化小鼠模型 | 小鼠品系（NTG）、肿瘤细胞接种量（3×10^6）、PBMC注射量（1×10^7）、抗体剂量（15 mg/kg）、给药频率（每三天一次） 阅读提示：Materials and Methods中的Mouse Tumor Model部分 |