动物感染与组织采集
建立ASFV感染猪模型并获取不同感染阶段的多器官样本，用于蛋白质组学分析。
对33头猪肌内注射ASFV CN/GS/2018毒株，在0、1、3、5、7天处死并采集13种组织，其中肾脏、颌下淋巴结和脾脏用于蛋白质组学分析。
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定量蛋白质组学分析鉴定未折叠蛋白反应为ASFV劫持以促进复制的宿主通路
Quantitative proteomic analysis identifies the unfolded protein response as a host pathway co-opted by ASFV to promote replication.
实验完整度
高包含体内动物感染模型、体外细胞感染模型、蛋白质组学分析、UPR分支激活验证、D117L功能与机制实验等多层级验证。
主要模型
猪（体内感染模型） 猪肺泡巨噬细胞（PAM） HEK293T细胞 iPAM细胞
重点核对
ASFV CN/GS/2018毒株感染猪的剂量和途径（肌内注射） 感染后时间点（0, 3, 5, 7天）和器官（肾脏、颌下淋巴结、脾脏） PAM细胞感染MOI 0.1和处理时间 UPR抑制剂浓度（4-PBA 50μM, 4μ8C 5μM, GSK2606414 0.5μM, Ceapin-A7 5μM） siRNA敲除效率和转染浓度
摘要
非洲猪瘟（ASF）由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起，是一种高度传染性疾病，影响猪只，给全球养猪业造成巨大经济损失。全面理解病毒-宿主蛋白相互作用有助于发现病毒感染的治疗方法。在本研究中，我们采用4D无标记定量蛋白质组学方法，对ASFV感染的猪进行了全面的蛋白质动力学分析，在多个器官中鉴定了超过6000种蛋白质。我们的结果揭示了以炎症激活和干扰素信号为特征的协调的器官间反应，以防御ASFV。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析揭示了ASFV诱导的功能模块，包括未折叠蛋白反应（UPR）、先天免疫信号和炎症，这些模块在不同组织中保守。值得注意的是，ASFV在体内和体外均强烈激活UPR的所有三个分支以促进病毒复制。此外，我们鉴定了病毒编码蛋白D117L与多种UPR相关宿主蛋白相互作用，从而直接触发UPR激活。总之，本研究描绘了ASFV感染的器官特异性蛋白质组图谱，为病毒-宿主相互作用提供了有价值的见解，并为ASF提供了潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ASFV感染如何劫持宿主未折叠蛋白反应（UPR）以促进自身复制？
- 核心机制
- ASFV编码蛋白D117L通过其跨膜域（38-60氨基酸）与宿主UPR关键组分HSPA5和CANX相互作用，激活UPR的所有三个分支（PERK、IRE1、ATF6），从而促进病毒复制。
- 主要证据
- 体内外实验显示ASFV感染激活UPR；功能筛选和免疫共沉淀验证D117L与HSPA5和CANX的相互作用；siRNA和化学抑制剂抑制UPR分支显著降低病毒复制。
- 研究意义
- 研究提供了ASFV感染的器官特异性蛋白质组图谱，揭示了D117L-UPR轴为潜在治疗靶点，为抗ASF药物开发奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质组学分析
鉴定ASFV感染后不同器官的蛋白质表达变化并识别关键通路。
使用4D无标记LC-MS/MS定量蛋白质组学分析组织样本，通过MaxQuant处理数据，通过DEP分析、TCseq、PPI网络和GSVA等识别差异表达蛋白和功能模块。
UPR激活验证
验证ASFV感染在体内外是否激活UPR及其三个分支。
通过qPCR和Western blot检测UPR标志物HSPA5以及PERK、IRE1、ATF6的磷酸化或剪切形式，在感染猪组织和PAM细胞中进行。
病毒蛋白筛选与功能鉴定
鉴定ASFV蛋白中负责激活UPR的关键因子。
通过共表达网络筛选10个候选病毒蛋白，在HEK293T细胞中过表达并检测UPR标志物HSPA5和ATF6荧光素酶报告基因，发现D117L为最强激活因子。构建D117L缺失突变体，确定38-60氨基酸跨膜域为激活UPR所必需。
D117L相互作用蛋白鉴定
揭示D117L激活UPR的分子机制。
通过免疫沉淀和质谱鉴定D117L及其突变体的相互作用蛋白，发现HSPA5和CANX为D117L的相互作用蛋白，并通过免疫共沉淀和免疫荧光验证。
UPR功能验证
验证UPR激活对ASFV复制的影响。
使用UPR抑制剂（4-PBA、4μ8C、GSK2606414、Ceapin-A7）或siRNA敲除UPR传感器（EIF2AK3、ERN1、ATF6）处理PAM细胞，评估ASFV复制水平（蛋白质、mRNA、病毒滴度）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 4-苯基丁酸 | -- | -- |
| 4μ8C | Med Chem Express | -- | |
| GSK2606414 | Med Chem Express | -- | |
| Ceapin-A7 | Med Chem Express | -- | |
| Western blot | GRP78/BIP兔多克隆抗体 | Proteintech | 11587-1-AP |
| 兔抗磷酸化PERK (Thr980)抗体 | Bioss | bs-3330R | |
| PERK兔多抗 | ABclonal | A18196 | |
| XBP1S特异性多克隆抗体 | Proteintech | 24868-1-AP | |
| 兔单抗(EPR5253)抗IRE1 (phosphoS724) | abcam | AB124945 | |
| IRE1; ERN1多克隆抗体 | Proteintech | 27528-1-AP | |
| ATF6多克隆抗体 | Proteintech | 24169-1-AP | |
| 单克隆抗Flag M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| Myc标签兔单抗(C端) | ABclonal | AE070 | |
| MYC标签小鼠单克隆抗体 | Proteintech | 60003-2-1g | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG (H+L)交叉吸附二抗, AlexaFluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| 山羊抗兔IgG (H+L)高交叉吸附二抗, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11037 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)交叉吸附二抗, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)超克隆二抗, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A28175 | |
| Western blot | GAPDH小鼠单克隆抗体 | Origene | TA802519M |
| β-微管蛋白小鼠单克隆抗体 | Proteintech | 66240-1-1g | |
| 抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8432 | |
| 转染 | Namipo转染试剂 | TranSheepBio | TSBBBR003 |
| RNA提取 | RNA提取试剂 | Vazyme | -- |
| 反转录 | HiScript II Q RT SuperMix | Vazyme | -- |
| qPCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| ABI StepOnePlus系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 质粒构建 | 一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
| 免疫沉淀 | Myc磁珠 | MCE | HY-K0206 |
| DYKDDDDK磁珠 | Selleck Chemicals | b26103 | |
| 荧光素酶报告基因 | pGL4.39(luc2P/ATF6 RE/Hygro) | Promega | E3661 |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1960 | |
| 转染 | PolyPlus转染试剂 | Polyplus Transfection | 101000046 |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5mg |
| 显微镜 | 蔡司共聚焦显微镜(LSM980) | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物感染 | 猪的品系、年龄（10周龄）、体重（~40kg）、感染剂量和途径（肌内注射） 阅读提示：Materials and Methods: Infection procedures |
| 细胞感染 | PAM细胞来源、培养条件（RPMI 1640+10%FBS）、感染MOI（0.1）和处理时间（24或36小时） 阅读提示：Materials and Methods: Animals, cells, and viruses; 图6图注 |
| 蛋白质组学 | LC-MS/MS参数、MaxQuant版本（v1.6.5.0）、数据库（Sus scrofa）、FDR<1%、DEP阈值 阅读提示：Materials and Methods: LC-MS/MS for protein identification and quantitation |
| UPR抑制剂处理 | 抑制剂浓度（4-PBA 50μM, 4μ8C 5μM, GSK2606414 0.5μM, Ceapin-A7 5μM）、溶解溶剂（DMSO）、预处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and Methods: Antibodies and inhibitors; 图6图注 |
| siRNA敲除 | siRNA序列、转染试剂（Namipo）、转染浓度（50pM）、敲除效率（文中未明确说明） 阅读提示：Materials and Methods: RNA interference and qPCR analysis |