重组蛋白表达与纯化
获得用于免疫小鼠的IBV刺突蛋白S2亚基保守区域蛋白。
构建pET28a-S860–1088重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，通过His标签亲和层析纯化，并用Western blot验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
传染性支气管炎病毒刺突蛋白S2亚基中鉴定出的两个新的保守线性B细胞表位
Two novel conserved linear B-cell epitopes identified in the S2 subunit of the infectious bronchitis virus spike protein.
实验完整度
高研究包括重组蛋白表达、小鼠免疫、单克隆抗体制备、表位鉴定（截短突变）、序列保守性分析和交叉反应性验证等多个实验层级。
主要模型
小鼠模型（BALB/c小鼠） SPF鸡胚肾细胞（CEK） Vero E6细胞 SP2/0骨髓瘤细胞
重点核对
免疫原为刺突蛋白S2亚基860-1088氨基酸重组蛋白 使用小鼠免疫和杂交瘤技术制备单克隆抗体 通过Western blot和间接免疫荧光鉴定表位 表位氨基酸序列：1040KWWND1044和1046KHELPDF1052 交叉反应性测试包括SD、M41和GD三种IBV毒株
摘要
由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的传染性支气管炎（IB）是一种鸡的传染性呼吸道疾病，对全球家禽业构成严重威胁。本研究通过小鼠免疫、杂交瘤细胞融合和克隆纯化，制备了四种靶向刺突蛋白S2亚基七肽重复区2（HR2）的单克隆抗体（mAbs）。Western blot和间接免疫荧光试验证实，这四种单克隆抗体均能特异性识别IBV。表位鉴定揭示了两个新的线性B细胞表位：1040KWWND1044，被mAbs 6A6和6E2识别；以及1046KHELPDF1052，被mAbs 6A1和6A9识别，这些表位在不同IBV谱系中是保守的。此外，这两个表位均暴露在刺突蛋白表面，表明其具有作为免疫学相关靶标的潜力。本研究有助于进一步阐明IBV S2亚基的结构和功能，并为IBV诊断技术的发展提供帮助。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IBV刺突蛋白S2亚基中是否存在新的保守线性B细胞表位，以及这些表位是否可作为诊断靶点？
- 核心机制
- 两个表位均位于S2亚基的HR2区域，且暴露于刺突蛋白表面，具有免疫原性。
- 主要证据
- 通过制备四种单克隆抗体，结合Western blot和IFA，鉴定出两个保守线性表位；序列分析和交叉反应性实验表明其在不同IBV谱系中高度保守。
- 研究意义
- 研究为理解IBV S2亚基的结构和功能提供了线索，并为开发广谱IBV血清学诊断方法提供了候选靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单克隆抗体制备
产生特异性识别IBV刺突蛋白S2亚基的单克隆抗体。
用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合，经HAT筛选和有限稀释克隆化，获得杂交瘤细胞。
表位鉴定
确定单克隆抗体识别的精确线性表位。
通过构建截短突变体，在Vero E6细胞中表达GST标记的刺突蛋白片段，利用Western blot和IFA检测抗体的识别情况。
表位保守性与交叉反应性评估
评估两个表位在不同IBV毒株中的保守性及单克隆抗体的交叉反应性。
比较800株IBV毒株的表位序列，分析第1044位氨基酸变异对抗体识别的影响，并通过IFA和Western blot测试不同毒株的反应性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白表达 | pET-28a载体 | -- | -- |
| Uniclone一步无缝克隆试剂盒 | Genesand Biotech | -- | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| 动物免疫 | 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞融合 | 聚乙二醇4000 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 间接免疫荧光 | DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| ECL底物 | Beyotime | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 表位鉴定 | pCMV-FLAG-GST载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达 | 重组蛋白片段：S860–1088；诱导条件：0.5 mM IPTG，16°C，12小时；纯化方式：His标签亲和层析。 阅读提示：Materials and methods 2.3 |
| 单克隆抗体制备 | 免疫剂量：60 μg；佐剂：完全/不完全弗氏佐剂；融合比例：10:1；筛选方法：IFA。 阅读提示：Materials and methods 2.4, 2.5 |
| 表位鉴定 | 截短突变体构建：将片段克隆至pCMV-FLAG-GST载体，转染Vero E6细胞；检测方法：WB和IFA。 阅读提示：Materials and methods 2.8 |
| 交叉反应性评估 | 毒株：SD (GI-19), M41 (GI-1), GD (GI-7)；感染MOI：0.1；IFA固定时间：36 hpi；WB裂解时间：24 hpi。 阅读提示：Materials and methods 2.6, 2.7; Results 3.5 |