临床样本外泌体miRNA测序
筛选与甲状腺癌肺转移相关的差异表达miRNA。
对甲状腺癌肺转移患者、淋巴结转移患者及健康对照的血清外泌体进行NGS测序，分析miRNA表达谱。
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外泌体miR-17通过NF-κB激活驱动甲状腺癌肺转移。
Exosomal miR-17 Drives Thyroid Cancer Lung Metastasis via NF-κB Activation.
实验完整度
高包含体外细胞模型（MRC-5、Cal62）、体内动物模型（裸鼠移植瘤及肺转移模型）、患者血清样本，并通过WB、ELISA、双荧光素酶报告基因等验证功能与机制。
主要模型
MRC-5胚胎肺成纤维细胞 Cal62甲状腺癌细胞 BALB/c-nu裸鼠皮下移植瘤模型 BALB/c-nu裸鼠尾静脉肺转移模型
重点核对
血清外泌体分离方法：超速离心（110,000×g，90分钟） miR-17-5p过表达细胞系：MRC-5和Cal62经慢病毒或mimic转染 体内实验动物：雌性BALB/c-nu裸鼠，4-6周龄，18-20g，每组n=5 皮下移植瘤模型：Cal62细胞5×10^6皮下注射，第7天起隔日尾静脉注射外泌体（100 μL） 肺转移模型：Cal62-miR-17细胞1×10^6尾静脉注射，4周后活体成像，5周后micro-CT
摘要
目的
转移至肺是甲状腺癌致死的主要原因之一，但其潜在分子机制仍不清楚。本研究旨在探讨在“种子与土壤”假说框架下，外泌体microRNA-17-5p（miR-17-5p）如何促进甲状腺癌肺转移。
方法
分析甲状腺癌肺转移患者和对照血清外泌体中的miR-17，发现转移病例中其水平升高。将miR-17转染至胚胎肺成纤维细胞（MRC-5），并将其上清液与甲状腺癌细胞（Cal62）共培养。使用集落形成、Ki67染色和Transwell实验评估细胞增殖和迁移。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹分析白细胞介素-6（IL-6）/白细胞介素-8（IL-8）水平以及核因子κB（NF-κB）/核因子κB抑制因子（NKRF）的表达。体内模型验证了miR-17的促转移作用。
结果
miR-17-5p在转移患者血清外泌体中显著富集。在MRC-5细胞中，它抑制NKRF、NF-κB信号传导，并增加IL-6和IL-8的分泌，从而增强Cal62的增殖和迁移。动物实验证实其在促进肿瘤生长和肺转移中的作用。
结论
外泌体miR-17-5p重塑肺微环境为促炎微环境，促进甲状腺癌定植，并提供潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 外泌体miR-17是否通过重塑肺微环境促进甲状腺癌肺转移？
- 核心机制
- 外泌体miR-17-5p靶向抑制NKRF，激活NF-κB信号通路，促进肺成纤维细胞分泌IL-6和IL-8，形成促炎微环境，从而利于甲状腺癌细胞定植和转移。
- 主要证据
- 体外实验显示miR-17-5p转染MRC-5细胞后NKRF下调、NF-κB上调，ELISA检测到IL-6/IL-8分泌增加，并增强Cal62细胞增殖和迁移；体内裸鼠模型证实外泌体miR-17-5p促进肿瘤生长和肺转移。
- 研究意义
- 血清外泌体miR-17可能作为非侵入性诊断标志物，并可作为潜在治疗靶点，为甲状腺癌肺转移的预防和治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外泌体功能验证
验证患者血清外泌体对肺成纤维细胞和甲状腺癌细胞行为的影响。
分离患者血清外泌体，与MRC-5共培养，收集条件培养基处理Cal62细胞，检测增殖和迁移能力。
miR-17靶向NKRF验证
验证miR-17-5p是否直接靶向NKRF。
利用双荧光素酶报告基因实验检测miR-17-5p与NKRF 3'UTR的结合，并通过Co-IP验证NKRF与NF-κB的相互作用。
miR-17-5p过表达/敲低功能研究
验证miR-17-5p在肺成纤维细胞中对NF-κB信号和炎症因子分泌的影响。
利用慢病毒或mimic/inhibitor在MRC-5细胞中过表达或敲低miR-17-5p，检测NKRF、NF-κB蛋白水平及IL-6/IL-8分泌。
体外共培养实验
评估外泌体miR-17介导的微环境改变对甲状腺癌细胞增殖和迁移的影响。
收集miR-17过表达MRC-5细胞的外泌体或条件培养基，处理Cal62细胞，检测增殖和迁移能力。
体内动物实验
验证外泌体miR-17-5p在体内对肿瘤生长和肺转移的促进作用。
建立皮下移植瘤和尾静脉肺转移模型，给予miR-17过表达外泌体处理，通过相关影像学和组织学评估肿瘤生长和转移。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11-879-020 |
| 胎牛血清 | Gibco | C0235 | |
| MEM培养基 | Gibco | 11095080 | |
| L-丙氨酰-谷氨酰胺 | Beyotime | C0211-100ml | |
| 青链霉素 | Gibco | 1514012 | |
| 外泌体分离 | 磷酸盐缓冲液 | Beyotime | C0221A |
| 明胶 | Beyotime | Y263031 | |
| Quetol-812环氧树脂 | HEAD Biotechnology Co., Ltd. | SPI-02660 | |
| 环氧丙烷 | J&K Scientific | E0016 | |
| 醋酸铀 | HEAD Biotechnology Co., Ltd. | SPI-02624 | |
| 柠檬酸铅 | HEAD Biotechnology Co., Ltd. | HD17810 | |
| Leica UC6超薄切片机 | Leica Microsystems | -- | |
| FEI Tecnai T20透射电子显微镜 | Field Electron and Ion Company | -- | |
| NanoSight NS 300纳米颗粒追踪分析仪 | Malvern | -- | |
| NTA软件2.3版 | Malvern Panalytical | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | P1005 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012S | |
| PVDF膜 | Beyotime | FFP33 | |
| TBST缓冲液 | Beyotime | ST671 | |
| 抗NKRF抗体 | Santa Cruz | sc-365568 | |
| 抗NF-κB抗体 | Santa Cruz | sc-8008 | |
| 抗TSG101抗体 | Proteintech | 67381-1-Ig | |
| 抗Alix抗体 | Proteintech | 67715-1-Ig | |
| 抗CD9抗体 | CST | 13403S | |
| 抗GAPDH抗体 | Bioss | bs-0755R | |
| ECL化学发光试剂 | Beyotime | C0221A | |
| iBright FL1500成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| 发光检测仪（Luminoskan Ascent） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 外泌体示踪 | PKH26荧光细胞连接试剂盒 | Sigma | PKH26PCL |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Beyotime | ST1723 |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 二抗（594纳米） | Zhongshanjinqiao | ZF-0516 | |
| DAPI染料 | cidabio | Bio-CD2477 | |
| 抗荧光衰减封片剂 | Beyotime | P0131 | |
| Zeiss LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026CN |
| 实时荧光定量PCR系统（AG 22331） | Eppendorf | AG 22331 | |
| 细胞增殖实验 | 甲醇 | Beyotime | Y037896 |
| 结晶紫 | Beyotime | C0121 | |
| EdU | Ruibo Bio | -- | |
| EdU试剂盒 | Ruibo Bio | C10310 | |
| 细胞迁移实验 | Transwell Boyden小室 | Corning | -- |
| Nikon Eclipse Ts2倒置显微镜 | Nikon | -- | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | MEIBIAO | MB-0049B |
| IL-8 ELISA试剂盒 | MEIBIAO | MB-0088B | |
| 免疫共沉淀 | 胰蛋白酶 | Gibco | 25200072 |
| Tris-HCl缓冲液（pH 7.4） | Beyotime | ST774 | |
| EDTA | Beyotime | Y257063 | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Eppendorf 5424离心机 | Eppendorf | -- | |
| Protein A/G磁珠 | Santa Cruz | -- | |
| 裂解缓冲液 | Invitrogen | FNN0021 | |
| 转染 | miR-17-5p模拟物 | RiboBio | miR1CM001 |
| miR-17-5p抑制剂 | RiboBio | miR2CM00 | |
| 阴性对照模拟物 | RiboBio | miR1N0000001-1-5 | |
| 阴性对照抑制剂 | RiboBio | miR2N0000001-1-5 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| NF-κB抑制实验 | JSH-23 | Selleckchem | -- |
| 动物实验 | BALB/c-nu裸鼠 | Spacepharma Beijing Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| IVIS Spectrum活体成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| Quantum GX微型CT扫描仪 | PerkinElmer | -- | |
| Leica RM2235切片机 | Leica Microsystems | -- | |
| 伊红 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Olympus BX53显微镜 | Olympus | -- | |
| 测序 | miRNeasy Micro试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| NEBNext小RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| Illumina HiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：Cal62（甲状腺癌）、MRC-5（胚胎肺成纤维细胞）；培养基：DMEM（Cal62）、MEM（MRC-5）；血清：10% FBS；培养条件：37°C、5% CO2 阅读提示：参见 Materials and Methods 2.3 Cell Lines and Cell Culture |
| 外泌体分离与鉴定 | 分离方法：超速离心（110,000×g，90分钟）；鉴定方法：NTA（NanoSight NS 300）、TEM（FEI Tecnai T20）、WB标记物（TSG101、Alix、CD9） 阅读提示：参见 Materials and Methods 2.4 Isolation of Exosomes, 2.5 NTA, 2.6 TEM, 2.7 WB |
| miR-17-5p转染 | 转染试剂：Lipofectamine 2000（Invitrogen）；miR-17-5p mimics/inhibitors（RiboBio）及其浓度（未明确）；转染时间：48小时 阅读提示：参见 Materials and Methods 2.16 Transfection |
| 双荧光素酶报告基因 | 质粒：NKRF WT/Mut；共转染试剂：Lipofectamine 3000；检测时间：48小时转染后 阅读提示：参见 Materials and Methods 2.8 Dual-Luciferase Reporter Assay |
| 体外功能实验 | 共培养方式：MRC-5条件培养基处理Cal62 24小时；增殖检测：集落形成（500 cells/孔，2周）、EdU（50 μM，12小时）、Ki67免疫荧光；迁移检测：Transwell（1×10^5 cells/200 μL，6-8小时） 阅读提示：参见 Materials and Methods 2.10 Immunofluorescence, 2.12 Cell Proliferation Assays, 2.13 Cell Migration Assays |
| 体内动物实验 | 小鼠品系：雌性BALB/c-nu裸鼠（4-6周，18-20g）；皮下移植瘤：Cal62细胞5×10^6皮下注射；外泌体注射：尾静脉，100 μL，隔日一次；肺转移模型：Cal62-miR-17细胞1×10^6尾静脉注射；评估：4周活体成像、5周micro-CT及H&E染色 阅读提示：参见 Materials and Methods 2.2 Animals, 2.17 Establishment of the Tumour Model in Nude Mice, 2.19 In Vivo Imaging and Micro-CT |