检测Tgr5表达变化
验证感染或炎症刺激是否影响Tgr5的表达。
用L.m.或LPS处理WT小鼠及BMDMs，通过qRT-PCR和免疫荧光检测Tgr5 mRNA和蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
胆汁酸受体Tgr5通过代谢和表观遗传沉默在细菌脓毒症期间防止巨噬细胞过度炎症
Bile acid receptor Tgr5 prevents macrophage hyperinflammation during bacterial sepsis through metabolic and epigenetic silencing.
实验完整度
高包含体内感染模型（Tgr5-/-和Tgr5LysMCre小鼠）和体外BMDM实验，结合转录组、代谢分析和表观遗传机制验证。
主要模型
小鼠骨髓来源巨噬细胞 Tgr5-/-小鼠 Tgr5LysMCre小鼠
重点核对
Tgr5在巨噬细胞中的表达水平 感染后小鼠生存率 血清细胞因子水平 糖酵解速率
摘要
自然科学；生物科学；免疫学；微生物学
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Tgr5如何通过代谢和表观遗传机制调控巨噬细胞炎症反应，从而影响细菌脓毒症的结局？
- 核心机制
- Tgr5维持巨噬细胞糖酵解和乙酰辅酶A产生，通过组蛋白乙酰化沉默促炎基因，防止过度炎症。
- 主要证据
- Tgr5缺陷巨噬细胞在L.m.刺激下表现高炎症、低糖酵解和Acly表达下降，补充乙酸可逆转炎症。
- 研究意义
- 揭示Tgr5作为代谢-表观遗传调控节点在脓毒症中的保护作用，为治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Klf5调控Tgr5转录
确认转录因子Klf5是否直接调控Tgr5表达。
通过ChIP、荧光素酶报告基因实验和siRNA敲低验证Klf5与Tgr5启动子区域的结合及功能。
评估Tgr5缺失对脓毒症易感性的影响
探究Tgr5在细菌脓毒症中的整体作用。
对Tgr5-/-和Tgr5LysMCre小鼠进行L.m.静脉感染，监测生存率、血清转氨酶和细菌载量。
分析Tgr5缺陷巨噬细胞的转录组和炎症表型
揭示Tgr5缺失对巨噬细胞炎症基因表达的影响。
对L.m.感染的WT和Tgr5-/- BMDMs进行RNA测序，分析差异表达基因和通路富集。
评估代谢变化
探究Tgr5缺陷如何影响巨噬细胞代谢。
通过Seahorse分析糖酵解和氧化磷酸化，检测葡萄糖摄取和Glut1表达。
验证Acly和乙酰辅酶A的作用
验证Acly抑制是否导致炎症增加，以及乙酸补充是否可以逆转。
用2-HC抑制Acly，检测Tnf和Il6表达；用乙酸处理Tgr5-/- BMDMs观察炎症变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 低糖DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31885049 |
| 胎牛血清 | Sigma | S0615 | |
| 小鼠M-CSF重组蛋白 | PeproTech | 315-02 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液 | PAN Biotech | P10-023100 | |
| 细菌培养 | 脑心浸液琼脂 | BD | 211065 |
| 脑心浸液肉汤 | BD | 211059 | |
| 药物处理 | 羟基柠檬酸三钾盐一水合物 | Santa Cruz Biotechnology | 232281-44-6 |
| 乙酸钠 | Roth | 6773.2 | |
| Tgr5激动剂（RO5527239） | -- | -- | |
| 牛磺石胆酸 | Sigma-Aldrich | 6042-32-6 | |
| 毛喉素 | Sigma-Aldrich | F3917 | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | 408727 |
| siGENOME SMARTpool鼠Klf5 siRNA | Horizon | D-062477-01 | |
| siGENOME非靶向siRNA #1 | Horizon | D-001210-01-05 | |
| siGLO红色转染指示剂 | Dharmacon | D-001630-02-05 | |
| 蛋白质印迹 | ATP柠檬酸裂解酶抗体 | Cell Signaling | 13390 |
| 磷酸化ATP柠檬酸裂解酶抗体 | Cell Signaling | 4331 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5441 | |
| 流式细胞术 | Glut-1抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-31960 |
| 2-NBDG | Invitrogen | N13195 | |
| 磷酸化mTOR（Ser2448）-PE偶联抗体 | Invitrogen | 12-9718-42 | |
| 磷酸化AMPK（Thr172）-FITC偶联抗体 | Bioss Antibodies | bs-4002R | |
| PPARγ多克隆抗体，PE-Cy7偶联 | Bioss Antibodies | bs-4590R | |
| 磷酸化Akt (Ser473)-PE-Cy7偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 88106 | |
| c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 13987 | |
| 免疫荧光 | TGR5多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-23182 |
| CD11b抗体 | eBioscience | 14-0112-82 | |
| Iba1抗体 | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| CLEC4F/CLECSF13抗体 | R&D Systems | AF2784 | |
| Hoechst染料 | -- | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | Millipore ChIP分析试剂盒 | Merck Millipore | 17-295 |
| 小鼠抗Klf5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398470-x | |
| 正常小鼠IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| RT-qPCR | TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | 4331182 |
| QuantiTect逆转录试剂盒 | Qiagen | -- | |
| cDNA合成试剂盒 | Biozym | -- | |
| RNA-seq | GenXpro MACE试剂盒 | -- | -- |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| Seahorse分析 | Seahorse XFe96细胞外流量分析仪 | Agilent | -- |
| MitoStress检测试剂盒 | Agilent | -- | |
| GlycoStress检测试剂盒 | Agilent | -- | |
| 生化检测 | ATP比色/荧光检测试剂盒 | Merck | Mak190 |
| 细胞因子检测 | MILLIPLEX小鼠细胞因子/趋化因子磁珠面板 | Merck Millipore | MCYTOMAG-70K |
| 转染 | 4D-Nucleofector® X单元 | Lonza | AAF-1003X |
| 细胞分选 | FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 显微镜 | LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BMDM分化条件：DMEM（1000mg/l葡萄糖）、10%FCS、10ng/ml M-CSF，培养9天 阅读提示：STAR★Methods, Primary BMDM culture and in vitro stimulation |
| 细菌感染 | L.m.感染剂量：小鼠静脉注射约10^4 CFU；体外BMDM刺激1×10^6 CFU/mL 阅读提示：STAR★Methods, Listeria monocytogenes infection; Primary BMDM culture |
| LPS处理 | LPS剂量：22.5μg/g体重，腹腔注射 阅读提示：STAR★Methods, Lipopolysaccharide (LPS) injections |
| 代谢分析 | Seahorse GlycoStress检测：10mM葡萄糖、2.5μM寡霉素、50mM 2-DG 阅读提示：STAR★Methods, Seahorse analyses of BMDMs |
| 抑制剂处理 | 2-HC浓度：5mM，预处理30分钟，与L.m.共孵育2或6小时 阅读提示：STAR★Methods, Primary BMDM culture and in vitro stimulation |