重组pE248R蛋白的表达与纯化
获得具有免疫原性的纯化pE248R蛋白。
将E248R基因克隆至pET-28a载体，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达，通过包涵体洗涤、变性、透析复性和镍亲和层析纯化，并通过SDS-PAGE和Western blot验证。
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非洲猪瘟病毒pE248R蛋白中单克隆抗体靶向的线性B细胞表位的鉴定
Identification of a Linear B-Cell Epitope in the African Swine Fever Virus pE248R Protein Targeted by Monoclonal Antibodies.
实验完整度
中包含重组蛋白表达纯化、动物免疫、单克隆抗体制备、表位作图及保守性分析和结构定位，但缺乏病毒感染功能验证。
主要模型
BALB/c小鼠 HEK293T细胞 SP2/0骨髓瘤细胞 大肠杆菌（DH5α和BL21）
重点核对
BALB/c小鼠（6-8周龄）免疫重组pE248R蛋白，三次免疫后加强注射 杂交瘤细胞融合使用SP2/0骨髓瘤细胞和PEG 单克隆抗体1E3和5H3的效价均为1:2.048×10^6，亲和力分别为1.578×10^10 L/mol和3.273×10^9 L/mol 表位定位使用P1-P4和P2-1~P2-4截短蛋白及合成肽D1-D3 pE248R蛋白表达诱导条件为0.2 mM IPTG，18小时
摘要
非洲猪瘟病毒（ASFV）是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，可导致非洲猪瘟，该病具有持续高死亡率。pE248R蛋白是ASFV的一种豆蔻酰化整合膜蛋白，是病毒感染性和某些早期进入后事件所必需的，使其成为研究ASFV预防和治疗的关键靶点。本研究用纯化的重组pE248R蛋白免疫BALB/c小鼠，产生了5株单克隆抗体（mAbs）。随后对所选单克隆抗体进行了进一步表征。通过鉴定不同pE248R蛋白肽段与这些单克隆抗体的反应性，筛选并鉴定了pE248R蛋白上的一个线性B细胞表位（87QEVALTQWMDAG98）。这些结果为分析pE248R蛋白的结构和功能提供了新的理论基础，特别有助于构建ASFV免疫原的全面B细胞表位图谱。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鉴定ASFV pE248R蛋白上被单克隆抗体识别的线性B细胞表位。
- 核心机制
- pE248R蛋白上存在一个线性B细胞表位87QEVALTQWMDAG98，该表位暴露于蛋白溶剂可及表面，且在不同ASFV流行株中保守。
- 主要证据
- 通过重组蛋白免疫小鼠获得5株单克隆抗体，利用截短蛋白和合成肽进行表位作图，鉴定出线性表位，且该表位与ASFV阳性猪血清反应。
- 研究意义
- 为分析pE248R蛋白结构和功能提供理论基础，有助于构建ASFV免疫原的全面B细胞表位图谱，可能对ASFV疫苗和诊断研究有贡献。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单克隆抗体的制备
获得特异性识别pE248R蛋白的单克隆抗体。
用纯化的重组pE248R蛋白免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞，并制备腹水进行纯化。
单克隆抗体的表征
评估抗体的滴度和亲和力。
通过iELISA测定纯化抗体的滴度和亲和力。
截短蛋白表达和表位定位
确定单克隆抗体识别的线性B细胞表位区域。
表达覆盖pE248R全长的一系列截短蛋白（P1-P4和P2-1~P2-4），通过ELISA检测各单克隆抗体与截短蛋白的反应性，确定表位区域。
精确定位线性表位并验证
精确定位最小线性表位并验证其免疫反应性。
合成重叠肽D1-D3，通过肽ELISA和斑点印迹确认真实表位，并检测其与ASFV阳性猪血清的反应性。
表位保守性和空间定位分析
分析表位的保守性及其在蛋白结构中的位置。
通过对40个ASFV分离株进行多序列比对分析表位保守性，并使用同源建模和PyMOL可视化表位在蛋白结构中的位置。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白表达 | pET-28a载体 | -- | -- |
| pET-32a载体 | -- | -- | |
| PCR扩增 | PrimeSTAR DNA聚合酶试剂盒 | TaKaRa | -- |
| 蛋白纯化 | 镍亲和层析 | -- | -- |
| 细胞培养 | DH5α感受态细胞 | Weidi Biotechnology | -- |
| BL21感受态细胞 | Weidi Biotechnology | -- | |
| HEK293T细胞 | 中国科学院上海细胞库 | -- | |
| SP2/0骨髓瘤细胞 | -- | -- | |
| 蛋白质分析 | 抗His标签单克隆抗体 | Solarbio | -- |
| ASFV阳性猪血清 | 中国兽医药品监察所 | -- | |
| 酶联免疫吸附试验 | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | -- | -- |
| TMB底物溶液 | -- | -- | |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光试验 | pCAGGS-pE248R质粒 | -- | -- |
| Cy3偶联的山羊抗小鼠IgG | Bioss | -- | |
| DAPI | Solarbio | -- | |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 蛋白表达诱导 | 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | 表达菌株、IPTG浓度（0.2 mM）、诱导时间（18h）、纯化方法（镍亲和层析） 阅读提示：Materials and Methods, 2.2. Purification of pE248R Protein |
| 单克隆抗体制备 | 免疫动物品系（BALB/c）、年龄（6-8周）、免疫次数（三次）、融合细胞（SP2/0） 阅读提示：Materials and Methods, 2.4. Cell Culture and Animals |
| 单克隆抗体表征 | 抗体滴度、亲和力测定方法（iELISA） 阅读提示：Materials and Methods, 2.6. Purification and Characterization of Monoclonal Antibodies |
| 表位作图 | 截短蛋白片段（P1-P4、P2-1~P2-4）、合成肽（D1-D3） 阅读提示：Materials and Methods, 2.8. Peptide Synthesis and Epitope Mapping; Results, 3.5. Antigenic Epitope Mapping and Identification of pE248R |
| 免疫荧光试验 | 细胞系（HEK293T）、转染质粒（pCAGGS-pE248R）、转染后时间（48h） 阅读提示：Materials and Methods, 2.7. Immunofluorescence Assay (IFA) |