EIU小鼠模型建立与SESN2表达检测
验证LPS诱导的EIU模型中SESN2表达水平变化。
通过玻璃体内注射LPS建立EIU模型，24小时后收集视网膜，使用Western blot检测SESN2蛋白表达。
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Sestrin2通过Nrf2-SLC7A11-GPX4信号轴对LPS诱导的铁死亡发挥新型保护作用
Sestrin2 Exerts a Novel Protective Effect Against LPS-Induced Ferroptosis via the Nrf2-SLC7A11-GPX4 Signaling Axis.
实验完整度
高包含体内EIU小鼠模型和体外BV2细胞实验两个独立证据层级，并通过AAV过表达、siRNA敲低及Nrf2抑制剂ML385进行功能与机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠EIU模型 BV2小胶质细胞
重点核对
C57BL/6小鼠（6-8周龄，18-20g） LPS玻璃体内注射剂量（1μL，125 ng/μL） AAV-SESN2过表达预处理时间（LPS前3周） BV2细胞LPS处理浓度（200 ng/mL）和siRNA浓度（50 nM） Nrf2抑制剂ML385处理浓度（5 μM）
摘要
葡萄膜炎是与全身性炎症性疾病相关的主要视力损害原因。目前皮质类固醇治疗受限于显著的长期副作用。Sestrin2（SESN2）是一种应激反应性抗氧化蛋白，参与调控铁死亡和炎症。本研究探讨SESN2在内毒素诱导的葡萄膜炎（EIU）模型中调节炎症和铁死亡的作用，旨在开发更安全的葡萄膜炎治疗替代方案。通过玻璃体内注射脂多糖（LPS）建立C57BL/6小鼠EIU模型，并联合或不联合过表达SESN2的腺相关病毒（AAV）处理。进行了临床评估、细胞因子谱分析和铁死亡标志物检测。此外，对BV2小胶质细胞进行基因修饰以过表达或沉默SESN2，随后分析炎症细胞因子的产生、氧化应激、铁死亡相关通路、线粒体功能以及Nrf2信号通路的参与。LPS处理后，体内和体外SESN2表达显著降低。AAV介导的SESN2过表达抑制了炎症反应。机制上，SESN2通过上调抗铁死亡蛋白（SLC7A11、GPX4）和减少脂质过氧化标志物（4-HNE）来抑制铁死亡。在体外，SESN2过表达减少了氧化应激和铁死亡，而SESN2敲低则加剧了这些效应。SESN2的保护作用由Nrf2激活介导，增强抗氧化防御和铁死亡抑制。抑制Nrf2逆转了SESN2的保护作用，强调了p62/Nrf2/GPX4轴在SESN2介导的铁死亡保护中的重要性。SESN2在通过Nrf2通路保护炎症和铁死亡中发挥关键作用，为葡萄膜炎治疗提供了一个有前景的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SESN2是否以及如何通过调节铁死亡在LPS诱导的葡萄膜炎中发挥保护作用？
- 核心机制
- SESN2通过激活Nrf2通路，上调SLC7A11和GPX4等抗铁死亡蛋白，抑制脂质过氧化和铁死亡，从而减轻炎症。
- 主要证据
- 在EIU小鼠模型中，AAV介导的SESN2过表达减轻了眼部炎症和视网膜功能损伤；在BV2细胞中，SESN2过表达减少了氧化应激和铁死亡，而敲低则加剧，且Nrf2抑制剂ML385逆转了保护效应。
- 研究意义
- SESN2作为葡萄膜炎治疗的潜在靶点，为急性葡萄膜炎及其他神经炎症和视网膜疾病的治疗策略提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AAV介导的SESN2过表达对EIU炎症的影响
评估SESN2过表达对LPS诱导的眼内炎症和视网膜功能的影响。
通过AAV-SESN2玻璃体内注射过表达SESN2，通过裂隙灯、眼底成像、H&E染色和ERG评估炎症和视网膜功能。
SESN2对微胶质细胞活化和铁死亡标志物的影响
探讨SESN2过表达是否通过抑制铁死亡减轻炎症。
通过视网膜平铺片IBA1染色观察微胶质形态，Western blot检测铁死亡相关蛋白（FTH1、GPX4、SLC7A11、4-HNE），ELISA和qPCR检测炎症因子。
体外BV2细胞SESN2过表达和敲低对铁死亡的影响
验证SESN2在体外对LPS诱导的氧化应激和铁死亡的调控作用。
使用慢病毒过表达SESN2（HBLV-SE）和siRNA敲低（si-SE），检测炎症因子（ELISA）、脂质过氧化（BODIPY-C11）、ROS（DCFH-DA）、铁离子（FerroOrange）、MDA、GSH/GSSG比值以及铁死亡相关蛋白表达。
SESN2对线粒体功能和形态的保护作用
探究SESN2是否通过保护线粒体功能抑制铁死亡。
检测线粒体膜电位（TMRM）、线粒体铁（Mito-FerroGreen）、线粒体ROS（MitoSox-Red）、线粒体脂质过氧化（MitoPeDPP），并通过TEM观察线粒体超微结构。
Nrf2通路验证
验证SESN2是否通过Nrf2通路调控铁死亡。
检测Nrf2、P-Nrf2、p62、SLC7A11和GPX4蛋白表达，并使用Nrf2抑制剂ML385处理，观察对SESN2保护作用的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EIU模型建立 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| AAV制备 | pHBAAV-CMV-MCS-T2A-mcherry质粒 | Hanbio Biotechnology | -- |
| Phanta超保真DNA聚合酶 | -- | -- | |
| Lipofiter转染试剂 | Hanbio Biotechnology | -- | |
| Benonase核酸酶 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Servicebio Technology | -- | |
| 基因沉默 | 小干扰RNA | GenePharma | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 基因过表达 | PGMLV-CMV-MCS-3×Flag-PGK-Puro质粒 | -- | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| qPCR | EZ-press RNA纯化试剂盒 | EZBioscience | -- |
| HiScript II Q RT SuperMix反转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| ChamQ Blue Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Meilunbio Biotechnology | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Abclonal Technology | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Meilunbio Biotechnology | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | GBCBIO Technologies | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | CL488-60004 | |
| 抗p62抗体 | Abcam | ab109012 | |
| 抗SLC7A11抗体 | Proteintech | 26864-1-AP | |
| 抗FTH1抗体 | Cell Signaling Technology | 4393T | |
| 抗SOD1抗体 | Affinity Biosciences | AF5198 | |
| 抗SOD2抗体 | Proteintech | 24127-1-AP | |
| 抗GPX4抗体 | Proteintech | 30388-1-AP | |
| 抗4-HNE抗体 | Bioss | bs-6313R | |
| 抗Nrf2抗体 | Proteintech | 80593-1-RR | |
| 抗磷酸化Nrf2抗体 | Bioss | BSM-52179R | |
| 抗SESN2抗体 | Proteintech | 66297-1-Ig | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Meimian Biotechnology | -- |
| ERG | 丙胺太林 | -- | -- |
| 托吡卡胺 | -- | -- | |
| 裂隙灯显微镜 | -- | -- | |
| Optomap 200Tx眼底成像系统 | -- | -- | |
| Espion Diagnosys系统 | Diagnosys LLC | -- | |
| 氧氟沙星眼膏 | -- | -- | |
| 1%美多丽 | -- | -- | |
| 3%羟丙甲纤维素凝胶 | -- | -- | |
| 0.5%丁卡因滴眼液 | -- | -- | |
| Histopathological analysis | 奥林巴斯BX51显微镜 | Olympus | -- |
| 铁离子检测 | FerroOrange试剂盒 | Dojindo | -- |
| TEM | Sorenson缓冲液 | -- | -- |
| EMBed 812树脂 | -- | -- | |
| Leica超薄切片机 | Leica | -- | |
| 日立透射电镜 | Hitachi | -- | |
| 氧化应激检测 | 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | -- | -- |
| MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 脂质过氧化检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Beyotime | S0131S |
| C11-BODIPY荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MitoPeDPP线粒体脂质过氧化探针 | Invitrogen | -- | |
| 铁检测 | FerroOrange荧光探针 | Dojindo | -- |
| Mito-FerroGreen线粒体铁探针 | Dojindo | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | 四甲基罗丹明甲酯 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Nrf2抑制 | ML385 | -- | -- |
| 平铺片免疫荧光 | 抗IBA1抗体 | Fujifilm Wako | 019-19741 |
| 二抗 | Invitrogen | A-11070 | |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Meilunbio | MA0222 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
| 图像定量 | ImageJ软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EIU小鼠模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重，LPS注射剂量和体积，AAV注射时间点 阅读提示：Methods 2.1 EIU Mouse Model and Interventions |
| AAV制备 | AAV血清型、启动子、滴度、注射体积 阅读提示：Methods 2.2 AAV Preparation |
| 细胞培养与处理 | BV2细胞来源、培养基、LPS浓度和处理时间、siRNA浓度 阅读提示：Methods 2.4 Cell Culture and Genetic Manipulation |
| 铁死亡检测 | 脂质过氧化、ROS、铁离子、GSH/GSSG、MDA检测的具体试剂浓度和孵育时间 阅读提示：Methods 2.12-2.15 |
| Nrf2通路验证 | Nrf2抑制剂ML385浓度和处理时间 阅读提示：Methods 2.17 Statistical Analysis 以及 Results 3.6 |