重组NS3和NS5A蛋白的表达与纯化
获得用于免疫羊驼和筛选纳米抗体的靶抗原蛋白。
将BVDV NS3和NS5A基因克隆至pET-30a载体，转化E. coli BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达，并通过Ni-NTA亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blot验证。
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靶向牛病毒性腹泻病毒NS3/NS5A的TAT融合纳米抗体的筛选与表征及其抗病毒应用
Screening and Characterization of TAT-Fused Nanobodies Targeting Bovine Viral Diarrhea Virus NS3/NS5A for Antiviral Application.
实验完整度
高包含体外细胞模型（MDBK）、重组蛋白表达与纯化、噬菌体展示文库构建与筛选、功能验证（抗病毒复制）及分子对接分析等多个独立证据层级。
主要模型
MDBK细胞 BVDV感染MDBK细胞模型 羊驼VHH噬菌体展示文库
重点核对
TAT-Nb7和TAT-Nb23的处理浓度10 μM BVDV感染复数（MOI）为1 处理时间0-48小时 使用非特异性对照纳米抗体（靶向PRRSV） RT-qPCR和Western blot检测病毒复制
摘要
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是造成全球养牛业重大经济损失的主要病原体。其多样的传播途径和无症状感染的特征使得控制其传播变得困难；迫切需要开发新的有效抗病毒策略。纳米抗体（Nbs）因其分子量小、结构稳定、特异性高、易于生产等优点，已成为一种有前景的新型抗病毒制剂。本研究利用噬菌体展示技术成功筛选出靶向BVDV关键功能蛋白NS5A的特异性纳米抗体Nb7。此外，通过将纳米抗体与细胞穿透肽TAT融合，有效地将其递送到Madin-Darby牛肾（MDBK）细胞中。结果表明，特异性靶向BVDV非结构蛋白NS5A的TAT-Nb7能显著抑制MDBK细胞中的病毒复制。总之，本研究表明TAT-Nb7有望成为预防和控制BVDV感染的治疗候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 筛选能够靶向BVDV NS3/NS5A的纳米抗体，并通过TAT融合实现细胞内递送，以验证其抗病毒效果。
- 核心机制
- TAT-Nb7通过TAT肽介导进入细胞，靶向NS5A蛋白，抑制BVDV的RNA复制和病毒蛋白表达。
- 主要证据
- 在MDBK细胞中，TAT-Nb7处理后，RT-qPCR显示病毒拷贝数显著降低（12-48小时），Western blot显示病毒E2蛋白表达减少（48小时）。
- 研究意义
- 为开发新型抗BVDV药物提供了潜在策略，填补了BVDV特异性治疗药物的空白。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
羊驼免疫与VHH噬菌体展示文库构建
产生针对NS3和NS5A的特异性纳米抗体库。
用NS3和NS5A重组蛋白免疫羊驼，提取PBMC RNA，经巢式PCR扩增VHH基因，克隆至pCANTAB-5E载体，构建噬菌体展示文库。
噬菌体展示生物淘选
筛选特异性结合NS3和NS5A的纳米抗体克隆。
以NS3或NS5A蛋白包被96孔板，加入噬菌体文库，经三轮淘选富集特异性噬菌体。
纳米抗体的鉴定与筛选
评估淘选后克隆的特异性与亲和力，选择最优纳米抗体。
通过i-ELISA检测克隆结合能力，测序分析CDR3，选择OD450最高的Nb7和Nb23。
TAT-纳米抗体融合蛋白的表达与纯化
制备用于细胞内递送和抗病毒评估的融合蛋白。
将Nb7和Nb23基因与TAT通过(G4S)3连接，克隆至pET28a-sumo载体，表达并纯化。
细胞毒性检测
确定融合蛋白的无毒浓度范围。
用不同浓度TAT-Nb7和TAT-Nb23处理MDBK细胞，通过CCK-8检测细胞活力。
细胞膜穿透验证
验证融合蛋白能进入细胞。
用10 μM TAT-Nb7或TAT-Nb23处理MDBK细胞，通过Western blot和IFA检测细胞内纳米抗体。
抗病毒效果评估
评估TAT-Nbs对BVDV复制的影响。
MDBK细胞感染BVDV后，用10 μM TAT-Nbs处理，通过RT-qPCR和Western blot检测病毒复制水平。
分子对接分析
预测TAT-Nb7与NS5A的结合模式。
使用AlphaFold3预测复合物结构，PISA分析相互作用，PyMOL可视化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 重组蛋白表达 | TB培养基 | -- | -- |
| 卡那霉素 | -- | -- | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| 重组蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸树脂 | -- | -- |
| 动物免疫 | 完全弗氏佐剂 | -- | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| i-ELISA | HRP标记的山羊抗羊驼IgG | Abcam | -- |
| 淋巴细胞分离 | 骆驼淋巴细胞分离试剂盒 | Solarbio | -- |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| cDNA合成 | SuperScript™ III第一链合成系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| 细胞膜穿透验证 | SUMO抗体 | ZSGB-BIO | -- |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | ZSGB-BIO | -- | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abmart | -- | |
| ECL化学发光检测系统 | -- | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| Takara PrimeScript RT预混液 | Takara | -- | |
| Western blot | 兔抗BVDV E2多克隆抗体 | Biosynthesis Biotechnology | -- |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abmart | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | 表达菌株E. coli BL21 (DE3)；诱导条件0.2 mM IPTG, 15°C, 12小时；纯化使用Ni-NTA树脂。 阅读提示：见2.2小节 |
| 羊驼免疫与文库构建 | 免疫剂量每次2mg NS3和2mg NS5A；免疫次数4次，间隔14天；使用完全/不完全弗氏佐剂；文库滴度5.2×10^11 pfu/mL。 阅读提示：见2.3小节 |
| 生物淘选 | 包被蛋白浓度10 μg/mL；噬菌体输入浓度4.4×10^12 pfu/mL；洗脱用0.1 M三乙胺；三轮淘选。 阅读提示：见2.5小节及表3、表4 |
| 细胞培养与处理 | MDBK细胞；BVDV感染MOI=1；感染2小时；TAT-Nb浓度10 μM；处理时间0-48小时。 阅读提示：见2.10和3.6小节 |
| 抗病毒效果评估 | RT-qPCR检测BVDV 5'UTR；Western blot检测E2蛋白；使用GAPDH作为内参；统计方法为单因素方差分析。 阅读提示：见2.10、2.11和3.6小节 |