空间代谢组学与转录组学分析
揭示HNSCC恶性转化过程中代谢和转录组的空间异质性
对4例口腔鳞状细胞癌患者样本进行AFADESI-MSI空间代谢组学检测，结合WGCNA分析鉴定与HNSCC起始相关的代谢模块，并通过空间转录组学验证嘌呤代谢在恶性上皮区域的高表达
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HNSCC的代谢组学和转录组学分析确定AMIGO2作为调节肿瘤微环境的治疗靶点
Metabolomic and transcriptomic profiling of HNSCC identifies AMIGO2 as a therapeutic target modulating tumor microenvironment.
实验完整度
高包含空间代谢组学、单细胞转录组学、批量多组学、体外细胞实验（shRNA敲低、共培养）、体内动物模型（皮下及原位舌癌模型）及临床样本验证，且涉及功能验证和机制验证（Co-IP、Western blot等）。
主要模型
HNSCC细胞系（Fadu、SCC-25） MOC-1小鼠口腔癌细胞系 3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞 C57BL/6小鼠皮下及原位舌癌模型 HNSCC及癌前病变患者临床样本
重点核对
嘌呤代谢通路在HNSCC恶性转化中异常激活（空间代谢组学数据、WGCNA分析） NT5E表达与预后相关（TCGA和meta-GEO队列单因素Cox回归） AMIGO2敲低抑制HNSCC细胞迁移侵袭、EMT和肌成纤维细胞分化 AMIGO2与PDK1直接结合并调节AKT-mTOR信号通路 shAMIGO2与抗PD-1联合治疗增强抗肿瘤免疫反应（原位舌癌模型）
摘要
大量研究表明代谢重编程与肿瘤微环境之间存在关系。在这里，我们利用空间代谢组学/转录组学、单细胞转录组学和批量多组学表征了头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的演进景观。在HNSCC恶性转化过程中发现了代谢异质性，其中嘌呤代谢显著富集。整合单细胞和批量数据，我们开发了一个与NT5E（嘌呤代谢的关键上游调节因子）相关的稳健的配体-受体特征（LRS），该特征可作为独立的预后指标。低LRS亚型与高比例的免疫细胞浸润和改善的免疫治疗反应相关。值得注意的是，体外和体内实验表明，LRS核心分子AMIGO2调节肿瘤相关的嘌呤代谢，其下调抑制肿瘤细胞侵袭和迁移，抑制肌成纤维细胞分化，并促进免疫效应细胞浸润。此外，将AMIGO2靶向治疗与抗PD-1治疗相结合可产生更好的疗效。在HNSCC和癌前病变患者的临床队列中也获得了一致的验证。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HNSCC恶性转化过程中代谢重编程如何重塑肿瘤微环境，并确定可干预的治疗靶点？
- 核心机制
- AMIGO2通过直接结合PDK1激活PDK1-AKT-mTOR信号轴，促进肿瘤细胞EMT、迁移侵袭，并驱动免疫抑制性微环境形成（与嘌呤代谢相关）
- 主要证据
- 空间代谢组学与转录组学鉴定嘌呤代谢异常；LRS模型预测预后；AMIGO2敲低在体外和体内抑制肿瘤进展并增强免疫细胞浸润；临床样本中AMIGO2表达与免疫抑制相关
- 研究意义
- AMIGO2作为HNSCC潜在治疗靶点，靶向AMIGO2联合抗PD-1可能提高免疫治疗疗效；LRS模型可作为预后和免疫治疗反应预测的生物标志物
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组学分析
在细胞水平上表征嘌呤代谢和肿瘤微环境异质性
整合4个公共HNSCC scRNA-seq数据集，经质量控制后对348,668个细胞进行聚类和亚聚类分析，比较正常与肿瘤组织细胞比例变化，计算嘌呤代谢评分
NT5E功能验证及配体-受体分析
验证NT5E在嘌呤代谢和肿瘤微环境重塑中的作用
使用NT5E抑制剂AB680处理Fadu细胞，进行RNA-seq和GSEA分析，并通过细胞-细胞通讯分析筛选NT5E相关的配体-受体对
LRS模型的构建与验证
开发并验证基于配体-受体的预后模型
基于NT5E相关配体-受体基因，使用Consensus Clustering将患者分为两类，再通过XGboost、LASSO、RSF等10种机器学习算法整合构建LRS模型，并在多个外部数据集和内部队列中验证其预后价值
AMIGO2体外功能实验
验证AMIGO2对肿瘤细胞行为及肿瘤微环境的影响
在Fadu和SCC-25细胞中通过shRNA敲低AMIGO2，检测嘌呤代谢相关蛋白、EMT标志物表达、迁移侵袭能力变化，并通过与3T3-L1共培养检测肌成纤维细胞标志物
AMIGO2机制研究
阐明AMIGO2调控肿瘤恶性行为的分子机制
通过Western blot检测敲低AMIGO2后PI3K、PDK1、AKT、mTOR的磷酸化水平，并通过Co-IP验证AMIGO2与PDK1的相互作用
AMIGO2体内功能验证
评估AMIGO2在体内对肿瘤生长和免疫微环境的影响
建立MOC-1细胞皮下和原位舌癌模型，给予shAMIGO2和/或抗PD-1治疗，监测肿瘤生长，通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞
临床样本验证
验证AMIGO2表达与HNSCC恶性进展及免疫微环境的相关性
通过IHC和多重免疫荧光检测临床样本中AMIGO2、CD8、CD56、FAP等的表达和分布
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间代谢组学检测 | AFADESI质谱成像平台 | -- | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 组织切片 | Leica CM 1950冰冻切片机 | Leica Microsystem | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | PAN | -- | |
| 基因敲低 | shRNA慢病毒载体 | HanBio | -- |
| Western blot | AMIGO2抗体 | HUAAN | ER1903-66 |
| GAPDH抗体 | CST | 5174S | |
| E-cadherin抗体 | CST | 3195S | |
| N-cadherin抗体 | CST | 13116S | |
| HPRT1抗体 | Proteintech | 15059-1-AP | |
| PAICS抗体 | Proteintech | 12967-1-AP | |
| Vimentin抗体 | CST | 5741S | |
| MMP9抗体 | CST | 13667S | |
| FAP抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-99313 | |
| α-SMA抗体 | Cell Signaling Technology | 19245 | |
| PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4292 | |
| 磷酸化PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 17366 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 磷酸化Akt (Thr308)抗体 | Cell Signaling Technology | 9275 | |
| 磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| PDK1抗体 | Thermo Fisher Scientific | A302-130A | |
| 磷酸化PDK1 (Ser241)抗体 | Cell Signaling Technology | 3061 | |
| mTOR抗体 | Abcam | ab134903 | |
| 磷酸化mTOR (S2481)抗体 | Abcam | ab137133 | |
| 免疫组织化学 | AMIGO2抗体 | HUAAN | ER1903-66 |
| HPRT1抗体 | Proteintech | 15059-1-AP | |
| PAICS抗体 | Proteintech | 12967-1-AP | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNA测序 | Ribo Zero Gold试剂盒 | -- | -- |
| Illumina HiSeq XTen测序平台 | Illumina | -- | |
| 体外药物处理 | AB680 | MedChemExpress | -- |
| 体内实验 | 抗PD-1抗体 | BioXCell | BE0273 |
| 同型对照抗IgG抗体 | BioXCell | BE0089 | |
| 流式细胞术 | 抗CD3e-Brilliant Violet 421™抗体 | BioLegend | 100336 |
| 抗CD8a-APC抗体 | BioLegend | 100712 | |
| 抗CD4-Brilliant Violet 510™抗体 | BD Biosciences | 563106 | |
| 抗TIM-3-PE/Cyanine7抗体 | BioLegend | 119716 | |
| 抗CD45-APC/Fire™ 750抗体 | BioLegend | 103154 | |
| 抗PD-1-PE/Dazzle™ 594抗体 | BioLegend | 135228 | |
| 抗NK1.1-PE抗体 | BD Biosciences | 557391 | |
| 细胞透化试剂 | BioLegend | 420801 | |
| 固定缓冲液 | BioLegend | 421002 | |
| 抗IFN-γ-PerCP/Cyanine5.5抗体 | BioLegend | 505822 | |
| 抗颗粒酶B重组-FITC抗体 | BioLegend | 372206 | |
| PE/Cyanine7大鼠IgG2a, k同型对照 | BioLegend | 400521 | |
| PE/Dazzlem 594大鼠IgG2a, k同型对照 | BioLegend | 400557 | |
| PerCP/Cyanine5.5大鼠IgG1, k同型对照 | BioLegend | 400425 | |
| FITC小鼠IgG1, k同型对照 | BioLegend | 400137 | |
| Beckman Navios流式细胞仪 | Beckman | -- | |
| 多重免疫荧光 | CD8抗体 | BIOSS | bsm-60735R |
| FAP抗体 | HUABio | ET1704-23 | |
| CD56抗体 | HUABio | HA601126 | |
| PANCK抗体 | HUABio | HA601138 | |
| 免疫共沉淀 | AMIGO2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-373699 |
| PDK1抗体 | Thermo Fisher Scientific | A302-130A | |
| 细胞培养 | SCC-25细胞系 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| Fadu细胞系 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 3T3-L1细胞系 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| MOC-1细胞系 | Meisen Chinese Tissue Culture Collections | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 空间代谢组学 | 样本类型：4例口腔鳞状细胞癌患者样本；切片厚度：10μm；溶剂：ACN/H2O (8:2)；流速：1.5 μL/min；喷雾电压：7 kV；扫描速度：0.2 mm/s 阅读提示：Methods: Spatial metabolomics (SM) detection |
| 单细胞RNA-seq分析 | 数据来源：4个公共HNSCC scRNA-seq数据集；质控标准：基因数500-6000，线粒体RNA<20%，总counts<40000；批次校正：harmony算法 阅读提示：Methods: Public single-cell RNA-seq (scRNA-seq) datasets collection and analysis |
| NT5E抑制实验 | 细胞系：Fadu；药物：AB680；处理浓度和时间：文中未明确说明；检测：Western blot、RNA-seq 阅读提示：Results: NT5E is aberrantly expressed in tumors...；Supplementary Fig. 4 |
| AMIGO2敲低体外实验 | 细胞系：Fadu、SCC-25；shRNA序列：见Supplementary Data 10；转染时间：48小时；筛选：嘌呤霉素 阅读提示：Methods: Cell lines and culture conditions |
| 迁移和侵袭实验 | 细胞密度：1×10^5 cells/well；侵袭实验：Matrigel包被，培养48小时；迁移实验：无Matrigel，培养24小时 阅读提示：Methods: Cell invasion and migration assays |
| 共培养实验 | 细胞：3T3-L1 (2×10^5 cells/well) 与MOC-1共培养；Transwell孔径：0.4 μm；共培养时间：72小时 阅读提示：Methods: Cell lines and culture conditions |
| 皮下肿瘤模型 | 小鼠：5-6周龄雄性C57BL/6；细胞：MOC-1 (sh-NC和sh-AMIGO2) 1×10^6；注射部位：腋窝；分组：Vehicle、Anti-PD-1 (10 mg/kg)、shAMIGO2、shAMIGO2+Anti-PD-1；每组8只；治疗周期：27天 阅读提示：Methods: In vivo tumor implantation and experimentation |
| 原位舌癌模型 | 小鼠：C57BL/6；细胞：MOC-1 7.5×10^5；注射部位：舌背黏膜下；治疗：同皮下模型 阅读提示：Methods: In vivo tumor implantation and experimentation |
| 流式细胞术免疫分析 | 抗体：CD3e, CD8a, CD4, TIM-3, CD45, PD-1, NK1.1, IFN-γ, Granzyme B；仪器：Beckman Navios；软件：FlowJo 10.8.1 阅读提示：Methods: Tumor-infiltrating immune cells flow cytometry analysis |
| 临床样本分析 | 样本：HNSCC和癌前病变患者组织；IHC评分标准：染色强度×阳性细胞比例；多重免疫荧光：CD8、CD56、FAP、PanCK抗体 阅读提示：Methods: Western blotting and IHC; Multiplex immunofluorescence |