建立PB核心蛋白的HyperTRIBE和STAMP系统
评估不同PB蛋白与编辑酶融合后的定位和编辑效率，选择最有效的组合。
构建9种PB核心蛋白与APOBEC1或ADAR2dd的N或C端融合，共32种，在HCT116细胞中诱导表达，通过免疫荧光检测定位，FACS分选后mRNA-seq分析编辑位点，计算编辑分数并比较。
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加工体相关mRNA的组成和动态的系统性表征
Systematic characterization of the composition and dynamics of processing body-associated mRNAs.
实验完整度
高包含多层级实验验证：体外细胞系（HCT116、HEK293T）中建立和验证编辑工具，FAPS分离PB结合RNA-seq验证，RIP-qPCR、RNAscope、smiFISH独立验证，长读长测序分析poly(A)尾及亚型，单细胞测序动态分析。
主要模型
HCT116细胞 HEK293T细胞 HEK293T细胞（LSM14A-TRIBE-ID） 单细胞（sc-LSM14A-TRIBE-ID）
重点核对
PB-TRIBE-STAMP使用APOBEC1-DDX6和LSM14A-ADAR2dd双编辑酶 FAPS分离PBs时使用mTagBFP2-LSM14A标记 RIP验证使用DDX6和EDC4抗体 LSM14A-TRIBE-ID使用100 nM雷帕霉素处理 XBP1剪接分析使用5 µM毒胡萝卜素处理
摘要
加工体（PBs）是由RNA和蛋白质组成的动态、无膜细胞器。虽然PB蛋白已被广泛表征，但系统性分析PB相关RNA的方法仍然有限。为了解决这一问题，我们开发了PB-TRIBE-STAMP，一种基于两种正交RNA编辑酶的工具。同时应用APOBEC1-DDX6和LSM14A-ADAR2dd，PB-TRIBE-STAMP分别在HCT116和HEK293T细胞中鉴定了1，639和2，577个PB相关mRNA。进一步的PB生化分离和RNA-seq验证了这些mRNA的编辑转录本确实富集在PBs中。将PB-TRIBE-STAMP与长读长测序相结合，揭示了PB相关转录本具有更短的poly(A)尾。许多mRNA 3' UTR亚型表现出亚型特异性的PB关联模式。此外，我们建立了一种基于TRIBE-ID的工具，以高时间分辨率表征mRNA-LSM14A/PB的关联，并揭示了在未折叠蛋白反应（UPR）期间LSM14A相关的XBP1转录本具有更高的剪接效率。最后，基于单细胞LSM14A-TRIBE-ID（sc-LSM14A-TRIBE-ID），我们证明了细胞周期进程中mRNA-LSM14A/PB关联的动态模式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何系统表征PB相关mRNA的组成和动态变化？
- 核心机制
- PB相关mRNA具有更短的poly(A)尾，且更长的3' UTR亚型更易与PB关联；LSM14A相关的XBP1转录本在UPR期间更高效剪接；mRNA-LSM14A/PB关联在细胞周期进程中动态变化。
- 主要证据
- PB-TRIBE-STAMP鉴定的mRNA通过FAPS和RNA-seq验证富集于PBs；RIP-qPCR、RNAscope和smiFISH验证了代表性靶标；长读长测序显示poly(A)尾缩短；LSM14A-TRIBE-ID和sc-LSM14A-TRIBE-ID分别揭示XBP1剪接动力学和细胞周期中的关联变化。
- 研究意义
- 提供了研究PB-RNA关联的新工具，能够以高分辨率和单细胞水平研究动态RNA-PB相互作用，可能有助于理解PBs在基因调控中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PB-TRIBE-STAMP鉴定双编辑靶标
共表达APOBEC1-DDX6和LSM14A-ADAR2dd，鉴定同时携带C-to-U和A-to-I编辑的mRNA。
在HCT116和HEK293T细胞中共表达两种融合蛋白，FACS分选后mRNA-seq，使用SAILOR分析编辑位点，计算编辑分数，比较单编辑和双编辑的关联，确定交集作为PB相关mRNA。
FAPS分离PBs验证编辑转录本富集
通过荧光激活颗粒分选分离PBs，验证编辑转录本确实与PBs相关。
在PB-TRIBE-STAMP细胞中表达mTagBFP2-LSM14A，裂解后基于BFP信号分选PBs，对分选的PBs和胞质部分进行RNA-seq，计算富集倍数并比较编辑分数。
长读长测序验证共编辑和poly(A)尾分析
使用ONT测序验证同一转录本上的共编辑事件，并测量poly(A)尾长度。
制备FLEP-seq2文库，使用ONT测序，分析共编辑频率和poly(A)尾长度，比较PB相关和非相关转录本。
亚型特异性PB关联分析
研究不同3' UTR亚型是否具有不同的PB关联程度。
利用长读长测序数据，鉴定串联3' UTR亚型，比较长亚型和短亚型的共编辑频率，并通过3' RACE、RIP-qPCR和smiFISH验证。
建立LSM14A-TRIBE-ID系统
开发基于雷帕霉素诱导二聚化的高时间分辨率工具，动态监测mRNA-LSM14A相互作用。
共表达FKBP-ADAR2dd-EGFP和LSM14A-FRB，雷帕霉素处理后不同时间点收集细胞，mRNA-seq分析编辑动态。
XBP1剪接动力学分析
分析LSM14A相关的XBP1转录本在UPR过程中的剪接效率。
在LSM14A-TRIBE-ID细胞中，雷帕霉素预处理1小时，然后加入毒胡萝卜素，在不同时间点收集RNA，扩增XBP1 cDNA并进行Illumina和ONT测序，分析剪接和编辑。
单细胞LSM14A-TRIBE-ID
在单细胞水平分析mRNA-LSM14A关联及其与细胞周期的关系。
用雷帕霉素处理或不处理LSM14A-TRIBE-ID细胞，进行Smart-seq3xpress单细胞RNA-seq，分析编辑水平和细胞周期轨迹。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | Tet-On 3G载体 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | Cellmax | SA301.02 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15070063 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 聚乙烯亚胺 | YEASEN | 40816ES03 | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 聚凝胺 | YEASEN | 40804ES76 | |
| 嘌呤霉素 | YEASEN | 60209ES10 | |
| 杀稻瘟菌素S | YEASEN | 60218ES10 | |
| RNA编辑诱导 | 多西环素 | YEASEN | 60204ES03 |
| 雷帕霉素 | YEASEN | 52404ES | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| TRIzol LS试剂 | Invitrogen | 10296028CN | |
| 文库构建 | Equalbit RNA BR检测试剂盒 | Vazyme | EQ212-01 |
| mRNA-seq文库构建试剂盒 | YEASEN | 12309ES96 | |
| FAPS | RNaseOUT核糖核酸酶抑制剂 | Invitrogen | 10777019 |
| RQ1脱氧核糖核酸酶 | Promega | M6101 | |
| RIP | 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | HY-K0010 |
| 小鼠RNase抑制剂 | Vazyme | R301-03 | |
| 蛋白A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 | |
| 蛋白酶K | NEB | P8107S | |
| Hifair III第一链cDNA合成试剂盒 | YEASEN | 11141ES60 | |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | YEASEN | 11201ES60 | |
| RNAscope | RNAscope多重荧光V2检测试剂盒 | ACD | 323110 |
| HMGA2探针 | ACD | 467111 | |
| XBP1探针 | ACD | 436251 | |
| SREBF2探针 | ACD | 492951 | |
| Opal570试剂 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | ProLong Glass防淬灭封片剂 | Invitrogen | P36984 |
| DAPI | MCE | HY-D0814 | |
| DDX6抗体 | Proteintech | 14632-1-AP | |
| EDC4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376382 | |
| EDC4抗体 | Proteintech | 17737-1-AP | |
| MYC标签抗体 | Proteintech | 66004-1-Ig | |
| HA标签抗体 | Roche | 11867423001 | |
| FLAG标签抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| CoraLite488标记山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00013-1 | |
| CoraLite594标记山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00013-4 | |
| CoraLite647标记小鼠抗兔IgG重链 | Proteintech | SA00014-6 | |
| FITC标记亲和纯化山羊抗大鼠IgG | Proteintech | SA00003-11 | |
| Co-IP | 细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 磁珠 | Vazyme | PB101-01 | |
| SDS上样缓冲液 | Beyotime | P0015F | |
| 小鼠IgG1同型抗体 | CST | 5415S | |
| HA标签小鼠单克隆抗体 | ABclonal | AE008 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Biodragon | BF03001 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Biodragon | BF03008 | |
| XBP1剪接分析 | 毒胡萝卜素 | MCE | HY-13433 |
| 单细胞测序 | 硅油 | Sigma-Aldrich | 371667 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Oligo dT引物 | -- | -- | |
| dNTP混合物 | Thermo Scientific | R0191 | |
| RNA酶抑制剂 | Takara | 2313A | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| 显微成像 | 卡尔蔡司显微镜（Axio Observer7） | Carl Zeiss | -- |
| 卡尔蔡司显微镜（LSM980） | Carl Zeiss | -- | |
| smiFISH | 奥林巴斯IX83倒置显微镜 | Olympus | -- |
| 活细胞成像 | BioTek Lionheart FX系统 | BioTek | -- |
| FAPS | SONY MA900细胞分选仪 | SONY | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PB-TRIBE-STAMP细胞生成 | HCT116和HEK293T细胞，共表达APOBEC1-DDX6和LSM14A-ADAR2dd，多西环素浓度和诱导时间 阅读提示：Methods 质粒构建和细胞系生成；图1a |
| FAPS分离PBs | mTagBFP2-LSM14A表达，PBs分选参数（BFP信号门控），细胞数量（20个150mm皿），裂解缓冲液组成 阅读提示：Methods P-body isolation using fluorescence-activated particle sorting |
| RIP-RT-qPCR验证 | 抗DDX6和抗EDC4抗体，交联条件（400 mJ/cm² UV），裂解液和洗涤缓冲液组成，抗体量（5 µg） 阅读提示：Methods RNA immunoprecipitation and RT-qPCR |
| 长读长测序 | ONT MinION，FLEP-seq2文库制备，poly(A)尾长度计算参数 阅读提示：Methods Long-read sequencing；数据处理的FLEP-seq2分析步骤 |
| LSM14A-TRIBE-ID | 雷帕霉素浓度和时间点（15、30、60、120分钟），靶标识别阈值（ES LFC>1, padj<0.001） 阅读提示：Methods 诱导编辑和数据处理；图5d |
| XBP1剪接分析 | 雷帕霉素和毒胡萝卜素浓度和处理时间，测序方法（Illumina和ONT），编辑位点定义 阅读提示：Methods XBP1 splicing analysis；图6a |
| 单细胞LSM14A-TRIBE-ID | 雷帕霉素处理时间，单细胞分选参数，Smart-seq3xpress协议，质控标准（>7000基因，>150,000 reads） 阅读提示：Methods Single-cell RNA sequencing 和数据处理部分 |