融合蛋白的表达、纯化与鉴定
获得具有反应原性的重组融合膜蛋白，用于制备疫苗。
利用SOE-PCR扩增不同组合的融合基因，克隆至pCold I载体，转化E. coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。
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融合膜蛋白亚单位疫苗候选物有效保护小鼠抵抗牛支原体感染
Fusion membrane proteins derived subunit vaccine candidates effectively protect against Mycoplasma bovis challenge in mice.
实验完整度
高包含重组蛋白表达纯化、小鼠免疫与攻毒保护实验、ELISA检测抗体和细胞因子、组织病理学分析等多层级验证。
主要模型
SPF BALB/c 小鼠 牛支原体贵州株 大肠杆菌 BL21(DE3)
重点核对
免疫剂量：每只小鼠100 μg融合蛋白 免疫次数：3次，间隔两周 攻毒剂量：1×10^10 CCU·mL-1牛支原体，攻毒途径：腿部肌肉注射 小鼠品系：SPF BALB/c 雌性小鼠，4周龄
摘要
牛支原体（M. bovis）是牛支原体病的病原体，该病可导致牛的呼吸道疾病、中耳炎、乳腺炎和关节炎，并给养牛业造成巨大的经济损失。尽管疫苗接种是预防牛支原体感染最有效的方法，但目前缺乏有效针对该病的商业化亚单位疫苗。本研究利用分离自中国贵州省的牛支原体菌株的膜蛋白M27、M32、M498和M663的不同组合，开发了几种亚单位疫苗候选物。随后，通过免疫和攻毒实验在小鼠中评估了亚单位疫苗候选物的免疫效力。结果表明，由不同蛋白融合体（M27-32、M27-498、M27-663、M27-32-498、M27-32-663、M27-498-663和M27-32-498-663）构建的牛支原体亚单位疫苗能诱导小鼠产生特异性抗体。此外，这些候选物还诱导了小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-6的显著分泌，提示诱导了Th1和Th2型免疫应答。在显微镜下，这些牛支原体亚单位疫苗候选物也能有效减轻牛支原体感染引起的肺组织损伤，表明它们对强毒牛支原体攻毒提供了良好的保护。在所测试的疫苗候选物中，M27-498-663和M27-32-498-663亚单位疫苗候选物展示了最强大的免疫效力，为有效控制牛支原体奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发基于牛支原体膜蛋白融合的亚单位疫苗候选物，并评估其在小鼠中的免疫效力。
- 核心机制
- 融合蛋白疫苗通过诱导特异性抗体和Th1/Th2型细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6）产生免疫应答，从而减轻牛支原体感染引起的肺组织损伤。
- 主要证据
- 通过ELISA检测到所有疫苗候选物均显著提高特异性抗体水平和Th1/Th2细胞因子分泌；组织病理学显示免疫组小鼠肺损伤减轻，其中M27-498-663和M27-32-498-663效果最佳。
- 研究意义
- 为有效控制牛支原体奠定基础，支持进一步在牛体内评估这些抗原用于疫苗开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫与攻毒实验
评估不同融合蛋白亚单位疫苗候选物在小鼠中的免疫保护效力。
将融合蛋白与弗氏佐剂乳化制备疫苗，皮下免疫小鼠三次，间隔两周，最后一次免疫后一周用牛支原体攻毒，观察临床症状并采集肺组织进行病理分析。
特异性抗体和细胞因子检测
评估疫苗诱导的体液和细胞免疫应答。
使用间接ELISA检测小鼠血清中融合蛋白特异性抗体和细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6）的分泌水平。
肺组织病理学分析
评估疫苗对牛支原体攻毒诱导的肺损伤的保护作用。
采集攻毒后小鼠的肺组织，经固定、脱水、包埋、切片、HE染色，在显微镜下观察病理变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达 | pCold I 载体 | -- | -- |
| 大肠杆菌DH5α | Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd | -- | |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd | -- | |
| 细胞培养 | 优质马血清 | Gibco | 16050122 |
| 蛋白质纯化 | His标签蛋白纯化试剂盒 | OMEGA | -- |
| Western blot | 山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶 | Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd | -- |
| ELISA | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Wuhan Colorful-Gene biological technology Co., Ltd | JYM0218Mo |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Wuhan Colorful-Gene biological technology Co., Ltd | JYM0540Mo | |
| 小鼠IL-4 ELISA试剂盒 | Wuhan Colorful-Gene biological technology Co., Ltd | JYM0011Mo | |
| 小鼠IL-5 ELISA试剂盒 | Wuhan Colorful-Gene biological technology Co., Ltd | JYM0191Mo | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Wuhan Colorful-Gene biological technology Co., Ltd | JYM0012Mo | |
| 疫苗制备 | 弗氏佐剂 | -- | -- |
| 动物实验 | SPF BALB/c小鼠 | Topgene Biotechnology Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 融合蛋白表达 | 表达菌株、诱导条件（IPTG浓度、温度、时间）、纯化方法 阅读提示：Methods部分：表达、纯化和重组融合蛋白的表征 |
| 免疫和攻毒 | 小鼠品系和年龄、分组及数量、疫苗剂量、免疫途径、免疫次数和时间间隔、攻毒菌株和剂量、攻毒途径和时间 阅读提示：Methods部分：免疫和攻毒实验；图1、表2 |
| 抗体和细胞因子检测 | ELISA方法、包被抗原、血清稀释、检测抗体、判定标准（OD450nm >0.268为阳性） 阅读提示：Methods部分：检测融合蛋白特异性抗体和细胞因子分泌；图3-5 |
| 组织病理学分析 | 肺组织固定、切片、染色步骤；观察指标 阅读提示：Methods部分：免疫和攻毒实验；图6 |