ADSCs体外鉴定
验证分离的ADSCs具有间充质干细胞表型和多向分化能力。
通过流式细胞术检测表面标记物（CD90、CD105阳性，CD19、CD34阴性），并通过成脂和成骨诱导分化、油红O和茜素红染色验证分化潜能。
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脂肪干细胞通过分泌肿瘤坏死因子-α刺激基因6抑制树突状细胞迁移以提高小鼠同种异体皮肤移植存活率
Adipose-derived stem cells inhibit dendritic cell migration by secreting tumor necrosis factor-α-stimulated gene 6 to improve the allogeneic skin transplantation survival rate in mice.
实验完整度
高包含体外细胞实验（DC2.4共培养、Transwell迁移、CCK-8）、体内小鼠皮肤移植模型（流式、免疫荧光、组织学、生存评分）及转录组分析（RNA-seq、RT-qPCR验证），并涉及功能验证（TSG-6敲低及回补）和机制验证。
主要模型
小鼠同种异体皮肤移植模型 DC2.4细胞系 原代脂肪干细胞
重点核对
ADSCs和TSG-6处理DC2.4细胞后CD80/CD86表达及迁移能力 体内移植模型中C组、A组、T组、Sh组的DC、巨噬细胞、淋巴细胞浸润 TSG-6浓度梯度（2 nM、4 nM、6 nM）对DC迁移的抑制作用 ADSCs-shTSG-6敲低效果及TSG-6补充恢复效应 转录组分析中DEGs（ADM、GHRH、SELENBP1、NDRG1）的差异表达
摘要
同种异体皮肤移植面临显著的免疫学挑战，主要是由树突状细胞（DCs）介导的免疫排斥。脂肪干细胞（ADSCs）具有免疫调节作用；然而，其调节DC功能的潜在分子机制仍不清楚。本研究旨在探讨ADSCs及其分泌的肿瘤坏死因子-α刺激基因6（TSG-6）对小鼠同种异体皮肤移植中DC的调节作用。移植后，受体接受ADSCs、TSG-6敲低ADSCs（ADSCs-shTSG-6）或对照处理。通过流式细胞术和免疫组织化学分析免疫细胞浸润和细胞因子表达。使用Transwell实验评估TSG-6对DC迁移的影响。通过转录组分析探索TSG-6相关的基因表达谱，并通过RT-qPCR验证。ADSC处理显著减少了DCs向受体的迁移，与ADSCs-shTSG-6处理相比，同时降低了巨噬细胞、淋巴细胞和促炎细胞因子的水平。ADSC来源的TSG-6抑制DC迁移，该效应在TSG-6敲低后减弱，并通过补充TSG-6恢复。转录组分析鉴定了一组由TSG-6调控的免疫相关基因（ADM，GHRH，SELENBP1，NDRG1）。这些发现表明，ADSCs通过分泌TSG-6抑制DC迁移来增强移植物耐受性，突出了TSG-6作为预防移植排斥的有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脂肪干细胞是否通过分泌TSG-6抑制树突状细胞功能，从而改善同种异体皮肤移植的存活？
- 核心机制
- ADSCs通过分泌TSG-6抑制DC迁移，减少巨噬细胞和淋巴细胞浸润，降低促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）表达，从而抑制免疫排斥。
- 主要证据
- 体外Transwell实验显示TSG-6浓度依赖性抑制DC迁移，敲低TSG-6削弱抑制作用，补充TSG-6恢复；体内移植模型中TSG-6和ADSCs降低皮肤DC数量、减轻组织学炎症，转录组分析显示免疫相关基因下调。
- 研究意义
- 该研究揭示了ADSCs通过TSG-6调节免疫的新机制，为开发新的免疫抑制疗法提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内验证ADSCs对DC表达的影响
评估ADSCs处理对移植皮肤中DC表达和炎症反应的影响。
建立小鼠同种异体皮肤移植模型，局部注射PBS或ADSCs，在术后第7天通过流式细胞术检测DC数量，免疫荧光检测CD80/CD86，H&E染色评估炎症浸润。
体外筛选关键免疫调节因子
确定ADSCs分泌的哪些因子对DC成熟和迁移起主要抑制作用。
将DC2.4细胞与ADSCs或候选因子（TSG-6、HGF、TGFβ、galectin-1）共培养，通过流式细胞术检测成熟标志物CD80/CD86，Transwell实验检测迁移，CCK-8检测增殖。
体内验证TSG-6对移植存活的影响
评估ADSCs分泌的TSG-6是否改善移植皮肤存活率。
建立四组动物模型（PBS、TSG-6、ADSCs、ADSCs-shTSG-6），监测术后14天皮肤坏死评分，并通过流式细胞术分析移植皮肤和脾脏中免疫细胞（DC、巨噬细胞、T细胞）表达。
体外验证TSG-6对DC迁移的抑制作用
验证TSG-6是否直接抑制DC迁移，并确认ADSCs分泌的TSG-6是关键因素。
Transwell实验使用CCL19作为阳性趋化因子，不同浓度TSG-6（2、4、6 nM）处理，以及ADSCs、ADSCs-shTSG-6、ADSCs-shTSG-6+TSG-6共培养，计数迁移细胞。
转录组分析及功能富集
探索TSG-6调控DC功能的分子机制。
对DC（对照、ADSC共培养、TSG-6处理）进行RNA-seq，鉴定差异表达基因，并通过RT-qPCR验证关键基因（ADM、GHRH、SELENBP1、NDRG1），进行GO和KEGG富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| RPMI-1640培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 细胞消化 | 0.25%胰蛋白酶/EDTA | Gibco | -- |
| ADSCs鉴定 | CD90抗体 | Elabscience | E-AB-F1283C |
| CD105抗体 | Elabscience | E-AB-F1233UE | |
| CD19抗体 | Elabscience | E-AB-F1004E | |
| CD34抗体 | Elabscience | E-AB-F1284D | |
| 流式分析 | FACSCalibur试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 成脂分化 | 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | MCE | -- |
| 地塞米松 | MCE | -- | |
| 胰岛素 | MCE | -- | |
| 吲哚美辛 | MCE | -- | |
| 油红O溶液 | Beyotime | C0158M | |
| 成骨分化 | β-甘油磷酸 | MCE | -- |
| 抗坏血酸-2-磷酸 | MCE | -- | |
| 茜素红S溶液 | Beyotime | C0148S | |
| 动物模型 | 美洛昔康 | MCE | -- |
| 组织消化 | 胶原酶Liberase TL | Roche | LIBIT-RO |
| 流式分析 | CD11c抗体 | Elabscience | E-AB-F0991C |
| MCHII抗体 | Elabscience | E-AB-F0990E | |
| LSRFortessa X-20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | Tree Star | -- | |
| 免疫荧光 | CD80抗体 | Proteintech | 66406-1-Ig |
| CD86抗体 | Bioss | bs-1035R | |
| Alexa Fluor 694抗小鼠IgG | -- | -- | |
| Alexa Fluor 488兔抗小鼠IgG | -- | -- | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | TSG-6重组蛋白 | R&D Systems | 2326-T |
| 肝细胞生长因子 | ThermoFisher | 315-23-500 | |
| 转化生长因子β | Bio-Techne | 7666-MB | |
| 半乳糖凝集素-1 | R&D Systems | 1245-GA-050/CF | |
| 流式分析 | CytoFLEX S流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室 | -- | -- |
| 结晶紫溶液 | -- | -- | |
| 成像与分析 | 奥林巴斯倒置荧光显微镜 | OLYMPUS | -- |
| Image J软件 | Media Cybernetics | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| Synergy LX酶标仪 | BioTek | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine™ 3000转染试剂 | Beyotime | C0533 |
| 流式分析 | CD11b抗体 | Elabscience | E-AB-F1081C |
| F4/80抗体 | Elabscience | E-AB-F0995E | |
| CD4抗体 | Elabscience | E-AB-F1097C | |
| CD8抗体 | Elabscience | E-AB-F1104E | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TNF-α抗体 | Thermor | AMC3012 | |
| IL-6抗体 | Thermor | YF370127 | |
| IL-1β抗体 | Abcam | ab205924 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (HRP) | Abcam | ab7090 | |
| 山羊抗小鼠IgG+IgM H&L (HRP) | Abcam | ab47827 | |
| PXi9化学发光成像系统 | Syngene | -- | |
| Transwell迁移实验 | 趋化因子配体19 | Abcam | Ab307797 |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | -- | -- |
| DNase I | -- | -- | |
| NanoDrop分光光度计 | -- | -- | |
| Qubit荧光计 | -- | -- | |
| 生物分析仪 | -- | -- | |
| Illumina HiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | QIAzol裂解试剂 | Qiagen | 79306 |
| Power cDNA合成试剂盒 | ThermoFisher | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara Bio | -- | |
| ROX参比染料 | Takara Bio | -- | |
| ABI PRISM 7500定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ADSCs分离与鉴定 | ADSCs来源、培养条件、表面标记物检测（CD90、CD105、CD19、CD34）、成脂/成骨分化诱导条件 阅读提示：Materials and methods: Cell preparation 和 Identification of ADSCs |
| 小鼠皮肤移植模型建立 | 供体/受体品系、年龄、性别、样本量、分组、细胞/药物注射剂量和部位、移植后处理 阅读提示：Materials and methods: Animal models 和 Figure 2 legend |
| DC2.4细胞处理与体外功能检测 | DC2.4细胞培养条件、ADSCs共培养比例、TSG-6/HGF/TGFβ/galectin-1处理浓度和时间、Transwell迁移检测条件、CCK-8增殖检测 阅读提示：Materials and methods: In vitro functional assays of DCs 和 Figure 3 legend |
| TSG-6敲低与回补实验 | siRNA/shRNA序列、转染试剂和浓度、ADSCs-shTSG-6构建、迁移实验中ADSC/ADSC-shTSG-6/加TSG-6处理 阅读提示：Materials and methods: ADSC transfection 和 Figure 8 legend |
| 转录组分析 | DC处理方式、RNA提取、文库构建、测序平台、差异基因筛选阈值、RT-qPCR验证基因 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing and data analysis 和 Figure 9 legend |