circRNA转录组鉴定
鉴定鸡成肌细胞和肌管中表达的circRNA。
使用circRNA-seq对鸡原代成肌细胞（GM组）和分化3天的肌管（DM组）进行转录组测序，通过生物信息学分析鉴定circRNA。
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METTL3以m6A依赖的方式促进鸡肌生成过程中CircSIK2的翻译
METTL3 facilitates the translation of CircSIK2 during chicken myogenesis in an m6A dependent manner.
实验完整度
高包含circRNA-seq、Ribo-seq和质谱筛选，circSIK2体外过表达/敲低功能实验，SIK2-176aa体内慢病毒注射，以及m6A机制验证（双荧光素酶、SELECT、RNA pulldown）。
主要模型
鸡原代成肌细胞 鸡胚胎成纤维细胞DF-1细胞系 7周龄隐性白洛克鸡和兴化鸡 1日龄雏鸡体内慢病毒注射模型
重点核对
鸡原代成肌细胞分离自E11鸡腿肌，GM组为50%融合度，DM组为分化3天 circSIK2过表达质粒pCD25-circSIK2和siRNA转染浓度（1 μg质粒或100 nM siRNA） SIK2-176aa慢病毒注射剂量：1×10^8 IU/mL，分三次注射于1日龄雏鸡胸肌（n=10） METTL3过表达质粒（pCD3.1-METTL3）与circSIK2共转染的浓度 m6A位点131的验证：SELECT方法和双荧光素酶报告基因
摘要
环状RNA（circRNA）通常被认为是一类新的非编码RNA（ncRNA），经常出现在真核转录组中。原则上，circRNA可能编码蛋白质，因为其中一些由外显子产生并具有内部核糖体进入元件。环状RNA有潜力作为未开发的新蛋白质生成库，然而编码circRNA的鉴定是一项艰巨的任务。在本研究中，我们开发了一种专门的策略，通过结合RNA测序、核糖体谱分析和质谱法来发现体内翻译的circRNA，从而发现大量编码circRNA。在鸡成肌细胞和肌管中总共发现了40,084个circRNA，其中15,332个具有预测的开放阅读框（ORF）。通过核糖体足迹，我们发现一组circRNA（4,069个）与翻译核糖体相关（ribo-circRNAs）。此外，共发现3,927个具有无限ORF的circRNA，其中860个与翻译核糖体相关（ribo-no-stop-codon circRNAs）。质谱法发现了5个跨越circRNA反向剪接接头的特异性肽段谱。circSIK2是ribo-circRNA之一，可被METTL3甲基化并翻译成SIK2-176aa，从而促进成肌细胞的增殖和分化以及肌肉肥大。我们的结果表明，在鸡肌生成过程中许多circRNA正在翻译，而METTL3可以增强circSIK2的翻译。据我们所知，只有两个circRNA翻译事件被报道由m6A介导。我们的研究将是第三个此类事件，并且是首次记录的家禽中可翻译circRNA的实例。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鸡骨骼肌中是否存在可翻译的circRNA，以及METTL3介导的m6A修饰是否调控circSIK2的翻译并影响肌生成。
- 核心机制
- METTL3以m6A依赖的方式甲基化circSIK2第131位腺苷，从而促进circSIK2的翻译产生SIK2-176aa，通过GHR-IGF-AKT通路和肌源性调节因子促进成肌细胞增殖、分化和肌肉肥大。
- 主要证据
- circRNA-seq、Ribo-seq和质谱鉴定出circSIK2可翻译；circSIK2过表达/敲低实验和SIK2-176aa过表达实验显示促进肌生成；慢病毒注射SIK2-176aa增加肌纤维直径和横截面积；双荧光素酶和SELECT实验证明METTL3甲基化circSIK2第131位腺苷。
- 研究意义
- 本研究首次在家禽中发现m6A介导翻译的circRNA，为黄羽肉鸡肌肉生长性状的改良提供了新的潜在基因和蛋白质（亚型）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
核糖体谱分析鉴定翻译circRNA
检测与翻译核糖体结合的circRNA，筛选潜在可翻译的circRNA。
对GM和DM组细胞进行Ribo-seq，将核糖体保护片段比对到circRNA反向剪接位点，鉴定ribo-circRNA。
质谱鉴定circRNA编码的内源肽
直接鉴定由circRNA反向剪接位点编码的内源肽段。
提取GM和DM组细胞中的小开放阅读框编码多肽（SEP），经nano-HPLC-MS/MS分析，将肽段与自定义数据库比对。
circSIK2特征分析
验证circSIK2的真实性、稳定性和表达模式。
通过Sanger测序验证circSIK2反向剪接位点，RNase R处理验证稳定性，qRT-PCR检测表达模式。
circSIK2的翻译能力验证
验证circSIK2能否编码SIK2-176aa蛋白。
构建circSIK2过表达载体和SIK2-176aa-FLAG表达载体，转染成肌细胞和DF-1细胞，Western blot检测，并在鸡组织中检测内源蛋白。
circSIK2对成肌细胞增殖和分化的功能研究
研究circSIK2对成肌细胞增殖和分化的影响。
通过过表达和敲低circSIK2，使用CCK-8、EdU、流式细胞术检测细胞周期和增殖，免疫荧光检测肌管形成，qRT-PCR和Western blot检测相关基因表达。
SIK2-176aa功能验证
验证SIK2-176aa单独是否具有与circSIK2类似的功能。
过表达SIK2-176aa，检测细胞增殖、分化、肌管形成，并通过慢病毒肌肉注射检测体内对肌纤维肥大的影响。
m6A修饰机制解析
确定METTL3是否通过m6A修饰调控circSIK2的翻译。
通过SRAMP预测m6A位点，双荧光素酶报告实验验证METTL3的作用位点，SELECT实验验证m6A修饰，RNA pulldown鉴定阅读蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| circRNA文库构建 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNeasy MinElute纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| VAHTS 总RNA测序文库制备试剂盒 | Vazyme | -- | |
| VAHTS DNA纯化磁珠 | Vazyme | -- | |
| 尿嘧啶-N-糖基化酶 | Cwbio | -- | |
| 核糖体谱分析 | TURBO DNase | Ambion | AM1907 |
| RNase I | Ambion | AM2294 | |
| SUPERaseIn RNase抑制剂 | Ambion | AM2696 | |
| RNA Clean & Concentrator-25试剂盒 | Biozym | -- | |
| Ribo-Zero Gold试剂盒 | Illumina | -- | |
| Truseq小RNA文库制备试剂盒 | Illumina | RS-200-0012 | |
| 小肽提取 | Bond Elute C8硅胶柱 | Agilent Technologies | -- |
| 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 蛋白质谱 | Nano Aquity超高效液相色谱系统 | Waters Corporation | -- |
| Q-Exactive plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap C18捕集柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap C18分析柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA酶处理 | RNase R | Epicenter Technologies | -- |
| cDNA合成和qRT-PCR | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| QuantStudio5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix试剂盒 | Toyobo | -- | |
| 抗体生成和Western blot | Ni-NTA琼脂糖 | Qiagen | -- |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | Transgen Biotech | -- |
| 抗CDKN1A抗体 | Bioss | bs0741R | |
| 抗CDKN1B抗体 | Bioss | bs0742R | |
| 抗CDKN2B抗体 | Bioss | bs4269R | |
| 抗细胞周期蛋白D2抗体 | Affinity Biosciences | AF5410 | |
| 抗IGF1R抗体 | Bioss | bs0680R | |
| 抗INSR抗体 | Bioss | bs0681R | |
| 抗AKT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化AKT1抗体 | Cell Signaling Technology | 4040 | |
| 抗MyoD抗体 | Abcam | ab16148 | |
| 抗MyHC抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | B103 | |
| 抗HNRNPA2B1抗体 | Hunan Fenghui Biotechnology | Fab6995 | |
| 抗GAPDH抗体 | Bioworld Technology | MB001 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Bioworld Technology | MB0009 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H&L)-HRP | Bioworld Technology | BS12478 | |
| 山羊抗兔IgG (H&L)-HRP | Bioworld Technology | BS13278 | |
| 质粒构建 | pCD25-ciR载体 | Geneseed Biotech | -- |
| pmirGLO双荧光素酶报告载体 | Promega | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 质谱检测circRNA编码蛋白 | 测序级胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| 荧光/多功能微孔板检测仪 | BioTek | -- | |
| RNA pull-down | F2-RNA pull-down试剂盒 | Fitgene | -- |
| EdU assay | EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷） | RiboBio | -- |
| C10310 EdU Apollo体外成像试剂盒 | RiboBio | -- | |
| Leica DMi8荧光显微镜 | Leica | -- | |
| 流式细胞术 | 细胞周期分析试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| BD AccuriC6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| CCK-8 assay | TransDetect CCK试剂盒 | Transgen Biotech | -- |
| Model 680微板阅读器 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG (H+L)-Dylight 594 | Bioworld | BS10027 |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 动物实验 | LV5慢病毒载体 | GenePharma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA-seq | 鸡原代成肌细胞分离和培养条件（培养基成分）；GM和DM时间点定义；RNA提取、RNase R处理、文库构建试剂盒；测序平台 阅读提示：Materials and methods: Animal and cell culture, Circular RNA library construction and deep sequencing |
| Ribo-seq | 细胞量（约1×10^6）；环己酰亚胺浓度和处理时间（100 μg/mL, 5 min）；RNase I浓度和处理时间（2 U/mL, 40 min）；RPF筛选标准（≥20个junction-spanning reads） 阅读提示：Materials and methods: Ribosome profiling of myoblasts |
| 质谱鉴定 | SEP提取中细胞量（约4×10^7）；富集柱类型（Bond Elute C8）；色谱柱规格和梯度；质谱仪参数（Q-Exactive Plus） 阅读提示：Materials and methods: Small open reading frames (smORFs) encoded polypeptides (SEPs) extraction and enrichment; Nano-HPLC-MS/MS analysis |
| 细胞功能实验 | 转染质粒量（1 μg）或siRNA浓度（100 nM）；CCK-8检测时间点和重复数（n=8）；EdU孵育时间和浓度（50 μM, 2 h）；流式细胞术细胞固定条件（70%乙醇）；分化诱导条件 阅读提示：Materials and methods: EdU assay, Flow cytometric analysis, CCK-8 assay, Immunofluorescence |
| m6A机制验证 | METTL3过表达质粒和circSIK2片段共转染浓度；双荧光素酶报告实验重复数（8）；SELECT方法中引物和连接酶条件；RNA pull-down中F2-Tag质粒量和转染时间 阅读提示：Materials and methods: Dual-luciferase reporter assay, SELECT, F2-RNA pulldown assay |
| 体内实验 | 慢病毒注射剂量（1×10^8 IU/mL）、注射次数和时间（第1、4、7天）、动物数量（n=10）；取样时间（首次注射后14天）；肌纤维统计数量（超过500个） 阅读提示：Materials and methods: Lentiviral intramuscular injections and HE staining |