临床样本和公共数据库分析
探究FXR、HVEM和PD-L1在NSCLC中的表达相关性
对178例NSCLC临床样本进行IHC染色，分析FXR、HVEM、PD-L1表达，并利用TCGA数据库验证NR1H4和TNFRSF14的mRNA相关性。
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FXR通过上调HVEM在PD-L1低/阴性非小细胞肺癌中塑造免疫抑制性微环境
FXR shapes an immunosuppressive microenvironment in PD-L1lo/- non-small cell lung cancer by upregulating HVEM.
实验完整度
高包含临床样本分析、体外细胞共培养、分子机制实验（ChIP、荧光素酶报告）和体内小鼠模型验证，多层级证据支持结论。
主要模型
A549和H1975人NSCLC细胞系 小鼠LLC细胞皮下移植瘤模型 178例临床NSCLC患者肿瘤样本
重点核对
FXR与HVEM在NSCLC中的表达相关性（IHC和TCGA数据） FXR拮抗剂（UDCA、DHP）对HVEM表达的剂量依赖性抑制 FXR/HVEM轴对CD8+ T细胞细胞因子产生和细胞毒性的影响 抗BTLA抗体在FXR高表达PD-L1低表达LLC肿瘤中的治疗效果 FXR对TNFRSF14启动子区域-3537/-3319序列的转录调控
摘要
免疫检查点疗法已经改变了癌症治疗，包括非小细胞肺癌（NSCLC）。PD-L1低/阴性肿瘤对抗PD-1/PD-L1免疫疗法无反应，归因于尚不清楚的替代性免疫逃逸机制。我们之前报道过法尼醇X受体（FXR）在PD-L1低/阴性NSCLC中升高。在此，我们发现免疫检查点HVEM在NSCLC中与FXR呈正相关，但与PD-L1呈负相关。HVEM在FXR高表达PD-L1低表达NSCLC中高表达。一致地，临床相关的FXR拮抗剂以剂量依赖性方式抑制NSCLC中HVEM的表达。FXR在体外抑制共培养CD8+ T细胞的细胞因子产生和细胞毒性，并在体内通过HVEM/BTLA通路在小鼠肿瘤中塑造免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。临床研究表明，FXR/HVEM轴与NSCLC患者的免疫逃逸TME和较差生存结局相关。机制上，FXR通过转录激活、细胞内Akt、Erk1/2和STAT3信号以及NSCLC细胞G1/S期进程上调HVEM。体内治疗实验表明，抗BTLA免疫疗法在FXR高表达PD-L1低表达小鼠Lewis肺癌中重振了TME中的抗肿瘤免疫，导致肿瘤抑制和生存改善增强。总之，我们的发现确立了FXR/HVEM轴作为PD-L1低/阴性NSCLC中的免疫逃逸机制，为该亚组患者未来的免疫治疗提供了转化意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FXR是否通过上调HVEM在PD-L1低/阴性非小细胞肺癌中塑造免疫抑制性微环境？
- 核心机制
- FXR通过转录激活、细胞内Akt、Erk1/2和STAT3信号通路以及细胞周期G1/S进程上调HVEM表达，进而通过HVEM/BTLA通路抑制CD8+ T细胞功能，塑造免疫抑制性TME。
- 主要证据
- 临床样本IHC和TCGA数据表明FXR与HVEM正相关、与PD-L1负相关；体外共培养实验显示FXR/HVEM轴抑制CD8+ T细胞细胞因子产生和细胞毒性；体内小鼠模型显示抗BTLA治疗恢复抗肿瘤免疫。
- 研究意义
- 本研究为PD-L1低/阴性NSCLC患者提供了新的免疫治疗靶点，支持靶向FXR/HVEM轴的免疫治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FXR对HVEM表达的调控
验证FXR是否正向调控HVEM表达
使用FXR拮抗剂处理NSCLC细胞和小鼠肿瘤，检测HVEM表达；通过过表达或敲低FXR观察HVEM变化。
FXR/HVEM轴对CD8+ T细胞功能的影响
评估FXR/HVEM轴对CD8+ T细胞细胞因子产生和细胞毒性的作用
将NSCLC细胞与CD8+ T细胞共培养，分析IFN-γ、TNF-α产生、凋亡率和LDH释放。
FXR/HVEM轴与临床预后和免疫浸润的相关性
探究FXR/HVEM轴与免疫细胞浸润和患者生存的关系
对178例NSCLC样本进行CD8、CD33、CD68免疫组化染色，分析免疫细胞浸润，并进行生存分析。
FXR上调HVEM的分子机制
阐明FXR上调HVEM的分子机制
通过ChIP和荧光素酶报告实验验证FXR对TNFRSF14启动子的转录调控；检测Akt、Erk1/2、STAT3信号通路和细胞周期的作用。
体内抗BTLA免疫治疗实验
评估抗BTLA免疫治疗对FXR高表达PD-L1低表达肿瘤的抗肿瘤效果
将FXR过表达或对照LLC细胞接种于C57BL/6小鼠，给予抗BTLA或同型对照抗体，监测肿瘤生长和生存，并分析TME免疫细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 熊去氧胆酸 | MedChemExpress | HY-13771 |
| 16-脱氢孕烯醇酮 | Santa Cruz | sc-287310 | |
| Z-古古甾酮 | Santa Cruz | sc-204414 | |
| MK2206 | MedChemExpress | HY-108232 | |
| PD0325901 | MedChemExpress | HY-10254 | |
| Stattic | Absin | abs812053 | |
| 帕博西尼 | Selleck | S1116 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| 免疫组织化学 | 抗胆汁酸受体NR1H4抗体 | Abcam | ab187735 |
| 抗HVEM/TNFRSF14抗体 | Santa Cruz | sc-365971 | |
| 抗PD-L1抗体 | Abcam | ab205921 | |
| 抗CD8α抗体 | Abcam | ab101500 | |
| 抗CD33抗体 | Abcam | ab270942 | |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| 抗FXR1抗体 | Abcam | ab155124 | |
| 抗HVEM/TNFRSF14抗体 | Proteintech | 10138-1-AP | |
| 抗PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 64988S | |
| 兔IgG | Abcam | ab172730 | |
| 小鼠IgG | Abcam | ab37355 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶/RNase染色缓冲液 | BD Pharmingen | 550825 |
| Western blotting | 抗磷酸化STAT3 (Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9145S |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 12640S | |
| 抗磷酸化Erk1/2 (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| 抗Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695S | |
| 抗磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 9271S | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 92310SF | |
| siRNA转染 | 脂质体3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 共培养实验 | Ficoll-Hypaque分离液 | Solarbio | P8900 |
| EasySep人CD8阳性分选试剂盒II | Stemcell Technologies | 17853 | |
| 抗CD3抗体 | BD Pharmingen | 555329 | |
| 抗CD28抗体 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 白细胞介素-2 | PeproTech | 200-02 | |
| 抗人BTLA抗体 | Adipogen | AG-20B-0049 | |
| 同型对照大鼠IgG1 | Adipogen | AG-35B-0012PF | |
| 流式细胞术 | CD3-APC抗体 | eBioscience | 17-0038-42 |
| CD8-APC-eFluor 780抗体 | eBioscience | 47-0088-42 | |
| TNF-α-FITC抗体 | eBioscience | 11-7349-81 | |
| IFN-γ-PE抗体 | eBioscience | 12-7319-41 | |
| 膜联蛋白V-FITC/PI试剂盒 | Beyotime | C1062M | |
| 细胞毒性检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | C0018M |
| 流式细胞术 | HVEM-APC抗体 | BioLegend | 318808 |
| CD45-FITC抗体 | BioLegend | 103108 | |
| CD3-PerCP-Cyanine5.5抗体 | BioLegend | 100218 | |
| CD4-PE-Cyanine7抗体 | BioLegend | 100422 | |
| HVEM-PE抗体 | BioLegend | 136304 | |
| PD-L1-APC抗体 | BioLegend | 124311 | |
| NK1.1-APC抗体 | BioLegend | 156506 | |
| BTLA-PE抗体 | BioLegend | 134804 | |
| IFN-γ-PE抗体 | BioLegend | 163503 | |
| 颗粒酶B-PE-Cyanine7抗体 | BioLegend | 372214 | |
| Foxp3-PE抗体 | BioLegend | 126404 | |
| CD11b-PE-Cyanine7抗体 | BioLegend | 101215 | |
| CD11c-PerCP-Cyanine5.5抗体 | BioLegend | 117328 | |
| F4/80-PE抗体 | BioLegend | 123110 | |
| CD206-APC抗体 | BioLegend | 162506 | |
| CD8α-APC-Cyanine7抗体 | ThermoFisher Scientific | A15386 | |
| Gr-1-APC-Cyanine7抗体 | BD Pharmingen | 557661 | |
| TNFα-eFlour 450抗体 | eBioscience | 48-7321-80 | |
| PD-1-eFlour 450抗体 | eBioscience | 48-9985-82 | |
| MHC-II-eFlour 450抗体 | eBioscience | 48-5321-80 | |
| 荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1960 |
| luminometer | Promega | -- | |
| ChIP实验 | SimpleChIP Plus酶法染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9005 |
| 抗人FXR/NR1H4抗体 | Cell Signaling Technology | 72105S | |
| 蛋白G磁珠 | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Image Lab分析系统 | Bio-Rad | -- | |
| 动物实验 | InVivoMAb小鼠IgG1同型对照 | BioXCell | BE0083 |
| InVivoMAb抗小鼠BTLA/CD272抗体 | BioXCell | BE0210 | |
| 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | |
| 小鼠淋巴细胞分离液 | Dakewe Biotech | DKW33-R0100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 样本量178例，FXR、HVEM、PD-L1的IHC评分标准，分组阈值 阅读提示：Methods: Patient samples, IHC analysis |
| 细胞培养与处理 | A549、H1975、LLC细胞系来源，培养基，FXR拮抗剂浓度和时间 阅读提示：Methods: Cell lines, Figure 2 legends |
| FXR调控实验 | FXR过表达或敲低的构建方法，siRNA序列，HVEM检测方法 阅读提示：Methods: Lentiviral constructs, siRNA transfection, Figure 3 legends |
| 共培养实验 | CD8+ T细胞分选方法，靶效比，抗BTLA浓度，共培养时间 阅读提示：Methods: Coculture assay, Figure 4 legends |
| 分子机制实验 | ChIP-qPCR引物覆盖区域，荧光素酶报告基因载体，信号通路抑制剂浓度 阅读提示：Methods: ChIP assay, Luciferase reporter assay, Figure 6 legends |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、年龄，LLC细胞接种量，药物剂量和给药方案，肿瘤测量频率 阅读提示：Methods: Animal experiments, Figure 7 legends |