双特异性亲和毒素的构建与表达
构建三种形式的GrB与双特异性亲和体ZHPV16-18E7的融合蛋白，并在大肠杆菌中表达和纯化。
将优化后的GrB基因通过(Gly4Ser)3连接肽分别融合至ZHPV16-18E7的N端、中间或C端，构建三种质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，并通过Ni2+亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blot验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种同时靶向HPV16/18型E7的新型双特异性亲和毒素：在HPV驱动的宫颈癌治疗中具有优异的抗肿瘤活性和EMT逆转作用
A novel bispecific affitoxin simultaneously targeting E7 of HPV16/18 types: superior anti-tumor activity and EMT reversal in HPV-driven cervical cancer therapy.
实验完整度
高包含体外细胞模型（SiHa/HeLa/C33A）的靶向结合、功能与机制验证，以及体内异种移植瘤模型的抗肿瘤效果、急性毒性与药代动力学评估。
主要模型
人宫颈癌细胞系SiHa（HPV16阳性） 人宫颈癌细胞系HeLa（HPV18阳性） 人宫颈癌细胞系C33A（HPV阴性对照） BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型（SiHa或HeLa）
重点核对
靶蛋白结合：SPR分析中，双特异性亲和毒素（Z16-GrB-18和Z16-18-GrB）与HPV16E7或HPV18E7的动力学参数（ka、kd、KD） 细胞结合：双特异性亲和毒素与SiHa（HPV16+）和HeLa（HPV18+）细胞的共定位（共聚焦免疫荧光） 细胞活力：CCK-8测定中，双特异性亲和毒素在SiHa和HeLa细胞中的IC50值，以及与C33A（HPV-）细胞的对比 细胞凋亡：TUNEL阳性细胞率及凋亡相关蛋白cleaved caspase-8和cleaved caspase-3的表达水平 体内抗肿瘤：异种移植瘤模型中的肿瘤体积、重量和生长曲线，给药剂量（100 nmol/kg vs 13 nmol/kg顺铂）
摘要
背景：高危型HPV16和18型的持续感染约占宫颈癌（CC）的75%，但目前尚缺乏旨在根除HPV感染的药物。尽管如此，基于亲和体的亲和毒素可能代表肿瘤靶向治疗的突破。我们之前的工作构建了一种同时靶向HPV16和18型早期致癌蛋白E7的双特异性亲和体（命名为ZHPV16-18E7）。在本研究中，引入颗粒酶B（GrB，细胞毒性效应分子）构建了三种双特异性亲和毒素，用于增强对HPV感染的宫颈癌细胞的治疗。方法：设计并制备了三种形式的亲和毒素构建体（GrB-ZHPV16-18E7，ZHPV16E7-GrB-ZHPV18E7，和ZHPV16-18E7-GrB），并通过SPR分析和共聚焦免疫荧光测定确认了它们与靶蛋白和细胞的结合。通过CellTiter-Lumi™发光测定法评估对细胞活力的抑制，通过荧光TUNEL方法评估凋亡的诱导，以及通过伤口愈合和transwell实验评估亲和毒素对靶细胞的EMT逆转。在荷瘤小鼠中评估了体内抑制效果以及亲和毒素的急性毒性、药代动力学和稳定性。结果：成功制备了两种双特异性亲和毒素ZHPV16E7-GrB-ZHPV18E7和ZHPV16-18E7-GrB。它们能与靶蛋白和细胞结合，也能抑制细胞活力。与双特异性亲和体（不含GrB）相比，双特异性亲和毒素诱导了更明显的以活性caspase-3释放为特征的凋亡，并可能通过逆转上皮-间质转化（EMT）途径抑制细胞迁移。在体内，双特异性亲和毒素在荷瘤小鼠中表现出显著的肿瘤靶向积累。与双特异性亲和体相比，双特异性亲和毒素对小鼠异种移植肿瘤的生长表现出更显著的抑制作用，无急性毒性反应，并具有一定程度的稳定性。结论：本工作开发了一种同时靶向HPV16和HPV18型宫颈癌细胞的的双特异性亲和毒素，具有显著的双功能优势，结合了亲和体的靶向抑制和毒素分子的细胞毒性。我们的研究为HPV驱动的宫颈癌的靶向治疗提供了一种新的设计和途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在开发一种同时靶向HPV16和HPV18型E7蛋白的双特异性亲和毒素（GrB-Z16-18，Z16-GrB-18，Z16-18-GrB），并评估其体外和体内的抗宫颈癌活性及安全性。
- 核心机制
- 双特异性亲和毒素通过亲和体靶向HPV16/18 E7蛋白进入癌细胞，利用GrB诱导caspase-8/3凋亡通路，并通过上调E-钙黏蛋白、下调波形蛋白和Snail来逆转上皮-间质转化（EMT）。
- 主要证据
- 体外：SPR和共聚焦显示Z16-GrB-18和Z16-18-GrB与E7结合；CCK-8/CellTiter-Lumi显示IC50降低并显著抑制细胞活力；TUNEL和Western blot显示凋亡增加及caspase-8/3活化；伤口愈合和transwell显示迁移抑制。体内：异种移植瘤模型中肿瘤抑制和肿瘤靶向积累（DyLight-755成像），且无急性毒性。
- 研究意义
- 该研究提供了一种基于亲和体的双特异性ADC（affitoxin）的新设计，同时靶向HPV16/18 E7，结合亲和体的靶向抑制和毒素的细胞毒性，为HPV驱动的宫颈癌的靶向治疗提供了新的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
靶蛋白结合动力学分析
验证双特异性亲和毒素与HPV16E7和HPV18E7的体外结合能力并测定动力学参数。
使用SPR（Biacore T200）将HPV16E7或HPV18E7固定在CM5芯片上，注入不同浓度的双特异性亲和毒素（300, 150, 75, 37.5, 18.75 μg/ml），记录响应信号，计算ka, kd, KD。
细胞结合与亚细胞共定位
验证双特异性亲和毒素能特异性地进入HPV16/18阳性宫颈癌细胞并与细胞内E7共定位。
将SiHa、HeLa或C33A细胞与双特异性亲和毒素（150 µmol/ml）共培养6小时，进行免疫荧光染色（anti-His-tag, anti-HPV16E7, anti-HPV18E7），用共聚焦显微镜观察。
细胞活力抑制测定
评估双特异性亲和毒素对宫颈癌细胞活力的抑制作用，并确定IC50。
使用CCK-8测定IC50，用梯度浓度（6.25-200 μg/ml）处理SiHa和HeLa细胞72小时；同时用CellTiter-Lumi™发光法测定100 μg/ml处理下的细胞活力，并以C33A作为对照。
细胞凋亡诱导测定
检测双特异性亲和毒素诱导宫颈癌细胞凋亡的能力。
使用DeadEnd™ Fluorometric TUNEL系统评估凋亡，并用Western blot检测凋亡相关蛋白（cleaved caspase-8, cleaved caspase-3）。
细胞迁移抑制和EMT逆转评估
检测双特异性亲和毒素对宫颈癌细胞迁移的抑制作用及其对EMT标志物的影响。
通过伤口愈合实验和transwell实验评估细胞迁移；用Western blot检测EMT相关蛋白（E-cadherin, Vimentin, Snail）。
体内肿瘤靶向成像
观察双特异性亲和毒素在荷瘤小鼠中的肿瘤组织富集情况。
将SiHa或HeLa细胞皮下注射到BALB/c裸鼠，待肿瘤生长后，尾静脉注射DyLight-755标记的亲和毒素（50 μM），通过近红外成像系统观察信号。
体内抗肿瘤效果评估
评估双特异性亲和毒素在异种移植瘤模型中对肿瘤生长的抑制作用。
当肿瘤体积达50 mm3时，尾静脉注射双特异性亲和毒素（100 nmol/kg）或顺铂（13 nmol/kg）阳性对照，共5次，间隔6天，记录肿瘤生长和体重，31天后解剖并比较肿瘤大小和重量。
急性毒性评估
评估双特异性亲和毒素在健康小鼠中的急性毒性。
对C57BL/6J小鼠静脉注射双特异性亲和毒素（8 μg/g），24小时后进行血常规、肝肾功能和H&E染色分析。
药代动力学和稳定性评估
评估双特异性亲和毒素在兔体内的药代动力学特征和血浆稳定性。
对新西兰兔静脉注射双特异性亲和毒素（4 mg/kg），在不同时间点采集血清，通过ELISA检测浓度；同时将亲和毒素（125 μg/mL）与兔血浆共孵育，评估稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | QIAGEN | -- |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | Sigma | -- | |
| SDS-PAGE凝胶电泳 | -- | -- | |
| 靶蛋白结合分析 | Biacore T200 | Cytiva | -- |
| CM5传感芯片 | -- | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| CellTiter-Lumi™发光细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 凋亡检测 | DeadEnd™荧光TUNEL系统 | Promega | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 化学发光检测试剂盒 | Pierce | -- | |
| 近红外成像 | DyLight-755 | Thermo Fisher Scientific | 62278 |
| Perkinelmer IVIS LuminaX5 | PerkinElmer | -- | |
| CRi Maestro 2.10 | CRi | -- | |
| 抗体 | 抗His标签抗体 | Proteintech | 66,005-1-Ig |
| 抗GrB抗体 | Abcam | ab208586 | |
| 抗Caspase-3抗体 | Abcam | ab32351 | |
| 抗Caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 4790 | |
| 抗GAPDH抗体 | Good Here | AB-P-R | |
| 抗HPV16E7抗体 | Bioss | bs-10446R | |
| 抗HPV18E7抗体 | Bioss | bs-10204R | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3195T | |
| 抗波形蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5741T | |
| 抗Snail抗体 | Cell Signaling Technology | 3879T | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0208 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Beyotime | A0216 | |
| Cy3标记的山羊抗小鼠IgG | Beyotime | A0521 | |
| FITC标记的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0562 | |
| ELISA | TMB底物 | Sigma | -- |
| 酶标仪 | Bio-Tek | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC编号）、培养基成分（RPMI-1640 + 10%FBS +青霉素/链霉素）、培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and methods 中的 Plasmids, cell lines and animals 部分 |
| 蛋白表达与纯化 | 表达宿主（E. coli BL21(DE3)）、诱导剂浓度（1 mM IPTG）、纯化方法（Ni2+亲和层析） 阅读提示：Materials and methods 中的 Protein preparation 部分 |
| SPR结合分析 | 固定靶蛋白浓度（10 μg/ml）、分析物浓度梯度（300-18.75 μg/ml）、流速（30 μl/min）和结合/解离时间（2/10 min） 阅读提示：Materials and methods 中的 SPR assay 部分 |
| 细胞活力测定 | 细胞密度（8×10^3/孔）、药物浓度（IC50测定梯度）、处理时间（72h）、阳性对照（顺铂浓度） 阅读提示：Materials and methods 中的 Cell viability assay 部分 |
| 体内抗肿瘤实验 | 细胞接种量（1×10^7）、给药剂量（0.1 nmol/g体重）、给药频次（间隔6天，共5次）、观察时间（至31天） 阅读提示：Materials and methods 中的 Anti-tumor growth in vivo 部分 |