动物模型建立与分组处理
建立PRRSV和DON共攻毒的断奶仔猪模型，并设置CON、DON、DON+GLU三组以评估GLU的保护作用。
18头21日龄断奶仔猪随机分3组（n=6），基础日粮或添加2.0 mg/kg DON和/或200 mg/kg GLU，喂饲2周后滴鼻接种PRRSV（105 TCID50/mL），继续处理3周。
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葡萄糖醛酸内酯通过增强Nrf2介导的抗氧化能力改善断奶仔猪PRRSV和DON共攻毒引起的肺损伤
Glucuronolactone improves lung injury caused by PRRSV and DON co-challenge by enhancing the Nrf2-mediated antioxidant capacity in weaning piglets.
实验完整度
高包含动物模型（断奶仔猪）和细胞模型（MARC-145）两个独立证据层级，并有功能验证（GLU处理）和机制验证（Nrf2抑制剂ML385）。
主要模型
断奶仔猪（Duroc × Landrace × Yorkshire，21日龄） MARC-145细胞（非洲绿猴肾细胞系） PRRSV（GD-ZJ株）感染模型 DON攻毒模型
重点核对
动物分组：CON、DON、DON+GLU，每组6头（n=6），公母各半 DON剂量：日粮中添加2.0 mg/kg；GLU剂量：日粮中添加200 mg/kg PRRSV感染：滴鼻接种2 mL PRRSV溶液（105 TCID50/mL） GLU处理时间：攻毒前2周和攻毒后3周；细胞实验中GLU浓度500 µg/mL，DON浓度500 ng/mL Nrf2抑制剂ML385处理验证Nrf2通路
摘要
在养猪业中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）攻击和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染都会对猪的生长性能产生负面影响，从而损害行业的健康发展。葡萄糖醛酸内酯（GLU）已被证明是一种强效抗氧化剂，有助于缓解氧化应激。因此，本研究旨在探讨GLU对PRRSV和DON共攻毒引起的氧化应激和肺损伤的影响。将18头断奶仔猪随机分为三组：对照组（CON）、DON组和DON+GLU组。在DON和/或GLU处理两周后，所有猪均肌内注射PRRSV，并继续用DON和/或GLU处理三周。PRRSV感染后三周，DON组仔猪表现出生长性能受损、严重肺损伤和病毒载量升高。相比之下，DON+GLU组仔猪生长性能和肺健康状况改善，病毒载量降低。GLU还抑制了PRRSV和DON在猪肺和MARC-145细胞中共攻击诱导的炎症、过度自噬和凋亡，表现为促炎因子、自噬标志物LC3和凋亡相关标志物表达降低。重要的是，GLU可以促进Nrf2的磷酸化和核转位，从而增强抗氧化能力并缓解PRRSV和DON共攻毒诱导的氧化应激。Nrf2抑制剂ML385消除了GLU对PRRSV和DON共攻毒引发的炎症和氧化应激的保护作用。这些发现表明，GLU可能通过激活Nrf2通路缓解氧化应激，从而减轻PRRSV和DON共攻毒引起的肺损伤，突显了其作为猪业膳食补充剂的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GLU是否能通过激活Nrf2通路减轻PRRSV和DON共攻毒引起的氧化应激和肺损伤？
- 核心机制
- GLU通过促进Nrf2的磷酸化和核转位，激活Nrf2介导的抗氧化信号通路，增强抗氧化能力，从而缓解氧化应激，并抑制过度自噬和凋亡。
- 主要证据
- 动物实验（断奶仔猪）和细胞实验（MARC-145）均显示GLU减轻肺损伤、降低病毒载量、抑制炎症和过度自噬/凋亡；使用Nrf2抑制剂ML385消除了GLU的保护作用，证实了Nrf2通路的关键作用。
- 研究意义
- GLU可作为猪业膳食补充剂，以缓解PRRSV和DON共攻毒引起的负面影响，为营养干预策略提供科学依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床观察与生长性能评估
评估GLU对共攻毒仔猪临床症状和生长性能的影响。
每日监测临床评分，实验前后称重计算平均日增重（ADG）和最终体重。
肺损伤与组织病理学分析
评估GLU对共攻毒仔猪肺部损伤的影响。
观察大体肺部病变，H&E染色进行组织病理学评分，计算肺指数。
病毒载量和PRRSV N蛋白表达检测
检测GLU对PRRSV复制的影响。
用绝对定量qPCR检测血清和肺组织中的病毒载量，用IFA和Western blot检测PRRSV N蛋白表达。
炎症与免疫反应评估
评估GLU对共攻毒引起的炎症反应的影响。
检测血清中细胞因子和免疫球蛋白水平，肺组织和细胞中炎症因子的mRNA和蛋白表达。
自噬与凋亡检测
评估GLU对共攻毒诱导的过度自噬和凋亡的抑制作用。
用透射电镜观察肺超微结构，Western blot检测自噬和凋亡相关蛋白，qPCR检测凋亡基因表达，IHC检测caspase-3。
氧化应激与Nrf2通路分析
评估GLU对共攻毒诱导的氧化应激的影响，并探究Nrf2通路的作用。
检测血清/肺组织中MDA、T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX活性，细胞内ROS水平，Nrf2通路相关蛋白表达及Nrf2核转位。
Nrf2抑制剂验证
验证GLU的保护作用是否依赖于Nrf2通路。
在MARC-145细胞中，用Nrf2抑制剂ML385处理，检测细胞活力、炎症因子表达、ROS水平及抗氧化基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 药物处理 | 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 | Sigma-Aldrich | 51481-10-8 |
| 葡萄糖醛酸内酯 | Sigma-Aldrich | 32449-92-6 | |
| 机制验证 | ML385 | Glpbio | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| iTaq通用SYBR Green PCR预混液 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白质印迹 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| SDS-PAGE凝胶 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 免疫组化 | 抗caspase-3单克隆抗体 | Cell Signalling Technology | -- |
| 免疫荧光 | PRRSV N单克隆抗体 | Bioss | -- |
| 蛋白质印迹 | 抗PRRSV N蛋白抗体 | Bioss | -- |
| 抗β-actin抗体 | Santa Cruz | -- | |
| 抗IL-1β抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗IL-6抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗P62抗体 | Abmart | -- | |
| 抗FUNDC1抗体 | HUABIO | -- | |
| 抗LC3A/B抗体 | Abmart | -- | |
| 抗Bax抗体 | Abmart | -- | |
| 抗Bcl-2抗体 | Abmart | -- | |
| 抗caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗Nrf2抗体 | Abmart | -- | |
| 抗磷酸化Nrf2抗体 | Abmart | -- | |
| 抗Keap1抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗HO-1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abmart | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | -- | |
| 化学发光检测 | ChemiDoc XRS成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式细胞术 | DCFH2-DA | Sigma-Aldrich | -- |
| 生化分析 | Selectra Pro XL全自动生化分析仪 | EliTechGroup | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | MEIMIAN | -- |
| 生化分析 | 检测试剂盒 | Biosino Biotechnology and Science Inc. | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | Aomabio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 动物分组（CON、DON、DON+GLU），每组6头；DON剂量2.0 mg/kg日粮，GLU剂量200 mg/kg日粮；PRRSV滴鼻接种2 mL（105 TCID50/mL）；处理时间（攻毒前2周+攻毒后3周） 阅读提示：Methods: Animal experimental design |
| 细胞实验 | MARC-145细胞培养条件（DMEM+10% FBS+抗生素）；GLU浓度500 μg/mL；DON浓度500 ng/mL；PRRSV感染时间2小时；处理总时间48小时 阅读提示：Methods: Viruses, cell lines, and compounds; Assessing the effect of GLU |
| Nrf2验证 | Nrf2抑制剂ML385的使用浓度和处理时间 阅读提示：Results: The specific Nrf2 inhibitor (ML385) negates... |
| 抗氧化指标检测 | MDA、T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX检测方法及试剂盒来源 阅读提示：Methods: Antioxidant capacity evaluation |
| 自噬和凋亡检测 | LC3A/B、p62、FUNDC1、Bax、Bcl-2、caspase-3等指标的检测方法及抗体信息 阅读提示：Methods: Western blot assay; Results: GLU mitigates excessive autophagy... |