体外氧化应激模型建立与AIMP1/SIRT1表达检测
确定在H2O2诱导的HEI-OC1细胞损伤中AIMP1和SIRT1的表达变化。
用1 mM H2O2处理HEI-OC1细胞2小时，通过qRT-PCR和Western blot检测AIMP1和SIRT1的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
AIMP1通过调节SIRT1表达在年龄相关性听力损失小鼠中发挥听力保护作用
AIMP1 exerts hearing protection role in age related hearing loss mice by regulating SIRT1 expression.
实验完整度
高包含体外H2O2损伤HEI-OC1细胞实验（CCK-8、流式、TUNEL、氧化应激和蛋白检测）、PINK1/SIRT1敲低挽救实验、以及D-半乳糖诱导的ARHL小鼠模型和AAV介导的体内过表达验证，实现了从细胞到动物模型的功能与机制验证。
主要模型
HEI-OC1细胞 D-半乳糖诱导的ARHL小鼠模型
重点核对
HEI-OC1细胞用1 mM H2O2处理2 h 细胞转染4 µg载体（AIMP1-OE、si-PINK1等）和10 µL Lipofectamine 2000 ARHL小鼠模型通过腹腔注射150 mg/kg/d D-半乳糖60天建立 AAV（1×10¹² v.g./mL）通过圆窗膜注射1 µL ABR阈值在AAV注射后8周测量
摘要
背景：年龄相关性听力损失（ARHL）是一种由多种因素引起的感觉神经性听力疾病，其发病机制尚不清楚。本研究旨在探讨AIMP1在ARHL中的具体作用。方法：用1 mM H2O2处理HEI-OC1细胞2小时以诱导细胞损伤。CCK-8、流式细胞术和TUNEL染色检测细胞活力和凋亡。DCFH-DA荧光探针评估ROS。通过试剂盒检测MDA、SOD和铜的水平。通过蛋白质印迹和免疫荧光检测与线粒体自噬和铜死亡相关蛋白的表达。最后，给小鼠注射D-半乳糖建立ARHL模型，以验证AIMP1在ARHL中的功能作用。结果：在H2O2处理的HEI-OC1细胞中，AIMP1和SIRT1下调。AIMP1过表达促进了细胞活力，降低了ROS和MDA水平，并提高了H2O2处理的HEI-OC1细胞中SOD水平。此外，在AIMP1过表达的情况下，H2O2处理的HEI-OC1细胞中铜水平和凋亡均降低。AIMP1过表达导致H2O2处理的HEI-OC1细胞中铜死亡相关蛋白FDX1、DLAT、DLST下调，线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、Mfn2和Drp1上调。敲低PINK1或SIRT1逆转了AIMP1过表达对H2O2诱导的HEI-OC1细胞损伤的影响。在体内，AIMP1过表达减少了耳蜗组织的损伤，并部分恢复了ARHL小鼠的听力。结论：AIMP1通过上调SIRT1促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，并抑制ARHL小鼠耳蜗毛细胞的铜死亡。因此，AIMP1可能是ARHL治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AIMP1是否通过调控SIRT1表达影响PINK1/Parkin介导的线粒体自噬和铜死亡，从而在年龄相关性听力损失中发挥保护作用？
- 核心机制
- AIMP1上调SIRT1，进而促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，并抑制耳蜗毛细胞的铜死亡。
- 主要证据
- 体外H2O2损伤HEI-OC1细胞模型中，AIMP1过表达提高细胞活力、降低ROS和铜水平、调节自噬和铜死亡相关蛋白；敲低PINK1或SIRT1逆转其保护作用。体内ARHL小鼠模型中，AAV介导的AIMP1过表达降低ABR阈值、减轻毛细胞损伤并恢复听力。
- 研究意义
- AIMP1可能成为ARHL治疗的潜在靶点，为ARHL的防治提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AIMP1过表达/敲低对细胞活力、氧化应激和凋亡的影响
评估AIMP1对H2O2处理的HEI-OC1细胞活力、氧化应激水平和凋亡的影响。
转染AIMP1-OE或si-AIMP1后，使用CCK-8检测细胞活力，DCFH-DA探针检测ROS，试剂盒检测SOD、MDA，流式细胞术检测凋亡。
AIMP1对线粒体自噬和铜死亡的影响
检测AIMP1是否调节线粒体自噬和铜死亡相关蛋白表达。
通过Western blot检测线粒体自噬相关蛋白（PINK1、Parkin、Mfn2、Drp1、LC3、ATG4D、Beclin1、p62）和铜死亡相关蛋白（FDX1、DLAT、DLST），免疫荧光检测PINK1和Parkin定位。
PINK1敲低挽救实验
验证AIMP1的保护作用是否依赖于PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。
共转染AIMP1-OE和si-PINK1后，检测细胞活力、氧化应激、凋亡、铜水平及蛋白表达变化。
SIRT1敲低挽救实验
验证AIMP1是否通过调节SIRT1表达发挥作用。
共转染AIMP1-OE和si-SIRT1后，检测细胞活力、氧化应激、凋亡、铜水平及蛋白表达变化。
体内ARHL小鼠模型验证
验证AIMP1过表达在ARHL小鼠中的听力保护作用及机制。
D-半乳糖诱导ARHL模型，通过圆窗膜注射AAV-AIMP1过表达，检测ABR阈值、耳蜗组织形态、氧化应激、凋亡、铜水平及蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | D-半乳糖 | MedChemExpress | -- |
| 腺相关病毒9型-CMV-AIMP1 | -- | -- | |
| Vetbond组织粘合剂 | Phymep | 1469SB | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素链霉素溶液 | -- | -- | |
| HEI-OC1细胞 | BFB Life Science | BFN60808695 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-PCR | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Biosharp | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | Biosharp | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗AIMP1抗体 | Abcam | ab188320 | |
| 抗SIRT1抗体 | Abcam | ab110304 | |
| 抗PINK1抗体 | Biodragon | BD-PN2037 | |
| 抗Parkin抗体 | Abcam | BD-PT3593 | |
| 抗Mfn2抗体 | Abcam | ab56889 | |
| 抗Drp1抗体 | Biodragon | BD-PT1414 | |
| 抗LC3抗体 | Abcam | ab192890 | |
| 抗ATG4D抗体 | Abcam | ab237751 | |
| 抗Beclin1抗体 | Abcam | ab207612 | |
| 抗FDX1抗体 | Abcam | ab108257 | |
| 抗DLAT抗体 | Boster | A04469-2 | |
| 抗DLST抗体 | Abcam | ab177934 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 二抗IgG-HRP | Abcam | ab0101/ab0102 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 氧化应激检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 超氧化物歧化酶活性检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 丙二醛含量检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 细胞MDA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 | Servicebio | -- |
| 免疫荧光 | 抗PINK1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 712654 |
| 抗Parkin抗体 | Proteintech | 66674-1-Ig | |
| 山羊抗兔Cy3-IgG | Beyotime | A0516 | |
| 山羊抗小鼠FITC-IgG | Beyotime | A0568 | |
| DAPI | -- | -- | |
| HE染色 | 伊红 | Beyotime | -- |
| 组织染色 | 抗肌球蛋白7a抗体 | Bioss | bs-7761R |
| 电生理检测 | TDT MF1-1250扬声器 | -- | -- |
| TDT II系统 | Tucker Davis Technologies | -- | |
| 微孔板读数 | Multiskan FC酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式细胞术 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 显微观察 | 荧光显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | HEI-OC1细胞培养条件（33°C、10% CO2），H2O2处理浓度1 mM、时间2 h 阅读提示：Methods：Cell culture |
| 细胞转染 | 转染载体量4 µg、Lipofectamine 2000用量10 µL 阅读提示：Methods：Cell transfection |
| 动物模型 | 小鼠品系C57BL/6雄性5-6周龄，D-半乳糖剂量150 mg/kg/d、给药途径腹腔注射、持续时间60天 阅读提示：Methods：Animal groups and treatment |
| AAV注射 | AAV血清型AAV9、启动子CMV、滴度1×10¹² v.g./mL、注射体积1 µL、注射速率0.2 µL/min、注射部位圆窗膜 阅读提示：Methods：Animal groups and treatment |
| ABR测试 | 测试时间点AAV注射后8周、频率8/16/28/40 kHz、刺激水平100 dB 阅读提示：Methods：ABR electrophysiological test |
| 样本量 | 每组动物数6只，组别为CON、Model、Model+Sham、Model+AAV-NC、Model+AAV-AIMP1 阅读提示：Methods：Animal groups and treatment |