临床样本收集与测序
分析CI患者术前和术后宫颈粘液微生物组的组成和结构差异。
收集CI孕妇术前和术后宫颈粘液，提取DNA，进行16S rRNA基因测序，分析微生物多样性和丰度。
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宫颈微生态在宫颈机能不全中的作用：来自16S rRNA宏基因组测序的见解
The role of cervical microbiome in cervical incompetence: insights from 16 S rRNA metagenomic sequencing.
实验完整度
中文献包含临床样本测序分析、细胞实验（CCK8、qRT-PCR、Western blot、ELISA）和机制验证，但缺乏动物模型等多层级验证，样本量有限。
主要模型
HcerEpic人宫颈上皮细胞 CI患者宫颈粘液样本 卷曲乳杆菌和GBS上清液处理模型
重点核对
样本来源：Shijiazhuang第四医院CI孕妇，术前术后宫颈粘液 菌株：L. crispatus ATCC 33197和GBS ATCC 13813 处理浓度：25%细菌上清液（1-30%梯度） 检测方法：qRT-PCR、Western blot、ELISA 细胞：HcerEpic，2.0×10^5细胞/皿，处理24h
摘要
宫颈机能不全（CI）被认为是导致中期妊娠流产和早产的关键因素，显著影响妊娠结局。尽管如此，微生物组在这一病理过程中的具体作用仍未被充分理解。本研究旨在阐明与孕妇CI相关的核心微生物组，并探讨其潜在的生物学机制。利用16S rRNA宏基因组测序，我们检测了CI女性术前（PreOp）和术后（PostOp）的宫颈粘液微生物群。随后，使用实时定量PCR、Western blotting和酶联免疫吸附试验系统评估了这些微生物群落对免疫系统的免疫调节作用。研究结果显示，PostOp宫颈粘液中的微生物多样性和丰富度显著降低，同时微生物组成发生显著变化。乳酸杆菌属、双歧杆菌属、加德纳菌属、链球菌属和厌氧球菌属被确定为主要菌属。进一步分析表明，与25% B族链球菌（GBS）上清液相比，用25%卷曲乳杆菌（L. crispatus）上清液处理HcerEpic细胞可维持高细胞活力和正常形态。重要的是，25%卷曲乳杆菌和25% GBS上清液的联合处理在体外显著降低了Toll样受体4（TLR4）、Toll样受体2（TLR2）和核因子κB（NF-κB）的mRNA和蛋白表达水平。这些结果表明，卷曲乳杆菌可能通过抑制TLR/NF-κB信号通路在CI中调节宫颈炎症，从而可能有助于在妊娠期间维持更稳定的宫颈微环境。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宫颈机能不全（CI）患者宫颈粘液微生物组的特征及其在病理过程中的潜在作用机制是什么？
- 核心机制
- 卷曲乳杆菌通过抑制TLR/NF-κB信号通路下调TLR4、TLR2和NF-κB的表达，从而调节宫颈炎症反应，维持宫颈微环境稳定。
- 主要证据
- 16S rRNA测序显示术后微生物多样性降低，乳酸杆菌丰度增加；体外实验显示卷曲乳杆菌与GBS联合处理可降低HcerEpic细胞中TLR4、TLR2和NF-κB的mRNA和蛋白表达，并增加IL-6水平。
- 研究意义
- 研究强调监测和管理生殖道微生物群的重要性，并提示卷曲乳杆菌可能作为恢复宫颈免疫稳态的潜在干预手段，以预防CI相关的不良妊娠结局，但需进一步体内研究验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细菌培养与上清液制备
制备卷曲乳杆菌和GBS的无菌上清液，用于后续细胞实验。
培养L. crispatus和GBS，离心收集上清液，过滤除菌，稀释至不同浓度。
细胞培养与处理
评估不同细菌上清液对宫颈上皮细胞活力和形态的影响。
培养HcerEpic细胞，用不同浓度的细菌上清液处理，观察细胞形态，进行CCK8实验。
基因表达检测
检测TLR4、TLR2和NF-κB的mRNA表达水平变化。
提取处理后的细胞RNA，逆转录，进行qRT-PCR，以GAPDH为内参，计算相对表达量。
蛋白表达检测
检测TLR4、TLR2和NF-κB的蛋白表达水平变化。
提取细胞总蛋白，进行Western blot，检测目标蛋白表达。
细胞因子分泌检测
评估细菌上清液处理对细胞因子分泌的影响。
收集处理后的细胞上清液，使用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6和TNF-α水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 卷曲乳杆菌ATCC 33197 | Shanghai Luwei Technology company | ATCC 33197 |
| B族链球菌ATCC 13813 | Shanghai Luwei Technology company | ATCC 13813 | |
| 细胞培养 | 人宫颈上皮细胞 | BeNa Culture Collection | -- |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| CCK8实验 | CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒 | Solarbio | Solarbio |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| PrimeScript cDNA合成试剂盒 | Takara | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Servicebio | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Servicebio | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | -- | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- | |
| 抗TLR4抗体 | BIOSS | -- | |
| 抗TLR2抗体 | BIOSS | -- | |
| 抗NF-κB抗体 | BIOSS | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Proteintech | -- | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Servicebio | -- | |
| ELISA | IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 16S rRNA测序 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 16S rRNA基因PCR引物 | -- | -- | |
| Illumina测序平台 | Illumina | -- | |
| 细菌计数 | 全自动菌落计数器 | Interscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本来源：Shijiazhuang第四医院CI孕妇；术前和术后宫颈粘液；伦理批准号：2023028 阅读提示：Materials and Methods - Samples |
| 16S rRNA测序与分析 | 测序平台：Illumina；序列处理参数：质量阈值、重叠长度等；OTU聚类相似度：97%；测序深度：均一化至59,433条序列 阅读提示：Materials and Methods - Construction of16S rRNA amplicon sequencing library |
| 细菌培养与上清液制备 | 菌株：L. crispatus ATCC 33197, GBS ATCC 13813；培养时间：72h和48h；离心条件：10,000 rpm, 4°C, 10min；过滤：0.22μm 阅读提示：Materials and Methods - Bacterial culture and supernatant separation |
| 细胞培养与处理 | 细胞系：HcerEpic；培养基：MEM+10% FBS+1% P/S；处理浓度：25%细菌上清液（梯度1-30%）；处理时间：24h；细胞密度：2.0×10^5/皿 阅读提示：Materials and Methods - Cell culture; Results - Effects of L. crispatus and GBS... |
| 基因和蛋白表达检测 | qRT-PCR：内参GAPDH，条件（95°C 10min, 95°C 10s, 60°C 1min, 40循环）；Western blot：抗体稀释比1:1000，内参GAPDH 阅读提示：Materials and Methods - qRT-PCR and Western blotting |