建立日本血吸虫病肝纤维化小鼠模型
建立感染小鼠模型以模拟血吸虫病肝纤维化过程。
雄性 C57BL/6 小鼠经皮感染约 25±2 条日本血吸虫尾蚴，于感染后第 36、37 天灌胃给予吡喹酮，第 57 天处死。通过 H&E、Masson 染色及 α-SMA、Col1a1 表达验证纤维化。
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CXCR6 招募 Th2 细胞并促进日本血吸虫病肝纤维化
CXCR6 recruits Th2 cells and promotes liver fibrosis in schistosomiasis japonica.
实验完整度
高包含单细胞测序、体外 Th2 极化实验、CXCR6KO 小鼠体内模型及组织学、流式、Western blot、RT-PCR 等多层级验证。
主要模型
C57BL/6 小鼠日本血吸虫感染肝纤维化模型 CXCR6KO 小鼠 小鼠原代 CD4+ T 细胞体外 Th2 极化模型
重点核对
小鼠品系（C57BL/6、CXCR6KO）及周龄（6 周） 感染方式：经皮感染约 25±2 条尾蚴 吡喹酮处理：500 mg/kg，感染后第 36、37 天灌胃 取材时间：感染后第 57 天
摘要
背景：血吸虫病是一种严重危害人类健康、阻碍社会发展的寄生虫病。虫卵在肝脏中的积聚可导致肉芽肿形成和肝纤维化。研究其免疫机制可能为血吸虫病揭示新的治疗靶点。方法：我们收集了感染血吸虫且发生肝纤维化的小鼠和健康小鼠的肝细胞进行单细胞测序，以探索纤维化肝脏中免疫细胞的异质性，并使用配体-受体分析检查细胞间通讯。结果：单细胞测序显示，在感染血吸虫的小鼠纤维化肝脏中，CXCL16-CXCR6 轴显著上调。巨噬细胞是 CXCL16 的主要来源，而 CXCR6 主要在 T 细胞中表达。血吸虫病小鼠肝脏中 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞显著增加，CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞中 CXCR6 也增加。在不同 T 细胞亚群中，Th2 细胞主要表达趋化因子受体 CXCR6。在 CXCR6KO 小鼠中，我们观察到肉芽肿面积减小，肝纤维化减轻。与野生型小鼠相比，CXCR6KO 小鼠肝脏中 CD4+ T 细胞显著减少，但 CD8+ T 细胞和 NKT 细胞无显著差异。此外，CXCR6KO 小鼠肝脏中 Th2 细胞显著减少，IL-13、IL-5 和 IL-4 水平也显著降低。体外实验中，在 Th2 极化条件下 CXCR6 显著上调。结论：Th2 细胞通过 CXCL16-CXCR6 轴被招募到肝脏，促进血吸虫病中的肉芽肿形成和肝纤维化。CXCR6 通路有望成为治疗血吸虫病相关肝纤维化的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 血吸虫病肝纤维化中，趋化因子受体 CXCR6 及其配体 CXCL16 的作用和机制是什么？
- 核心机制
- 在血吸虫病肝纤维化中，巨噬细胞来源的 CXCL16 通过 CXCL16-CXCR6 轴招募肝脏中的 Th2 细胞，促进肉芽肿形成和肝纤维化。
- 主要证据
- 单细胞测序显示 CXCL16-CXCR6 轴上调；CXCR6KO 小鼠中肉芽肿面积减小、纤维化减轻，Th2 细胞及 IL-13、IL-4、IL-5 水平降低；体外 Th2 极化条件下 CXCR6 上调。
- 研究意义
- 研究表明 CXCR6 通路可能作为治疗血吸虫病相关肝纤维化的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞测序及细胞通讯分析
探索纤维化肝脏中免疫细胞异质性及细胞间配体-受体相互作用。
对感染小鼠和健康小鼠的肝细胞进行单细胞测序，使用 Seurat 聚类和 CellChat 分析趋化因子信号通路。
验证 CXCL16 和 CXCR6 的表达及细胞来源
确定 CXCL16 和 CXCR6 在纤维化肝脏中的表达水平及主要细胞来源。
使用 Western blot 检测 CXCL16 蛋白水平；通过流式细胞术检测巨噬细胞中 CXCL16 表达，以及 T 细胞、NK 细胞等免疫细胞中 CXCR6 的表达和亚群分布。
评估 CXCR6KO 小鼠的纤维化表型
在体内验证 CXCR6 缺失对血吸虫病肝纤维化的影响。
CXCR6KO 小鼠和野生型小鼠均感染血吸虫，通过 H&E 染色测量肉芽肿面积，Masson 染色和 COL1A1 免疫组化评估胶原沉积，Western blot 检测 α-SMA 蛋白水平，RT-PCR 检测 α-SMA 和 Col1a1 表达。
分析 CXCR6KO 小鼠肝脏 T 细胞及 Th2 细胞变化
检验 CXCR6 缺失是否影响肝内 T 细胞亚群及 Th2 细胞数量和功能。
通过流式细胞术检测 CXCR6KO 和野生型小鼠肝脏中 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、NKT 细胞比例，以及 Th2 细胞（IL-13、IL-4、IL-5）比例和细胞因子水平。
体外验证 Th2 极化对 CXCR6 表达的影响
验证 Th2 细胞分化过程中 CXCR6 的表达变化，以支持其介导 Th2 细胞趋化。
从小鼠脾脏分离初始 CD4+ T 细胞，用 anti-CD3/CD28 激活，在 IL-2 和 IL-4 存在条件下诱导 Th2 极化 72 小时，流式检测 CXCR6 表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 吡喹酮 | -- | -- |
| 肝细胞分离 | GentleMACS 组织解离器 | Miltenyi | -- |
| IV 型胶原酶 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶 I | -- | -- | |
| RNA 提取 | SteadyPure 快速 RNA 提取试剂盒 | Accurate Biology | -- |
| RT-PCR | 通用 SYBR Green 预混液 | ABdonal | -- |
| Western blot | RIPA 裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| 抗 α-SMA 抗体 | Zenbio | 1:1000 | |
| 抗 CXCL16 抗体 | Proteintech | 1:500 | |
| HRP 标记二抗 | -- | -- | |
| 超敏化学发光试剂 | Zenbio | -- | |
| T 细胞分离培养 | 初始 CD4+ T 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| RPMI 1640 培养基 | -- | -- | |
| T 细胞激活 | 抗 CD3ε 抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗 CD28 抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Th2 极化 | 重组小鼠 IL-2 | PeproTech | -- |
| 重组小鼠 IL-4 | PeproTech | -- | |
| 免疫组化 | 抗 COL1A1 抗体 | servicebio | -- |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料 | BioLegend | -- |
| Fc 受体封闭试剂 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CD45-Super bright 600 | BioLegend | -- | |
| CD11b-FITC | BioLegend | -- | |
| F4/80-APC-Cy7 | BioLegend | -- | |
| Ly6G-APC | BioLegend | -- | |
| CD3-FITC | BioLegend | -- | |
| CD4-PerCP-Cy5.5 | BioLegend | -- | |
| CD8-PE-Cy7 | BioLegend | -- | |
| NK1.1-BV421 | BioLegend | -- | |
| CD19-APC-Cy7 | BioLegend | -- | |
| CXCR6-PE | BioLegend | -- | |
| CXCR6-PE-Cy7 | BioLegend | -- | |
| 细胞内细胞因子染色 | 白细胞激活混合物 | BD Biosciences | -- |
| 流式细胞术 | IL-13-PE | eBioscience | -- |
| IL-5-BV421 | BioLegend | -- | |
| CXCL16-PE | Bioss | -- | |
| BD FACS Canto II 流式细胞仪 | BD | -- | |
| 数据分析 | Seurat 程序 | -- | -- |
| CellChat | -- | -- | |
| ImageJ 软件 | -- | -- | |
| FlowJo 软件 | -- | -- | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | -- | |
| R 4.0.2 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、周龄、感染尾蚴数量、吡喹酮剂量及给药时间、取材时间 阅读提示：Methods 中 Hepatic fibrosis mice model of schistosomiasis japonica 部分及 Figure 1A、5A |
| 肝细胞分离 | 胶原酶 IV 浓度、DNase I 浓度、消化时间、Percoll 浓度、离心条件 阅读提示：Methods 中 Liver dissociation and preparation 部分 |
| 单细胞测序分析 | 数据来源、Seurat 版本、差异基因筛选阈值、CellChat 分析参数 阅读提示：Methods 中 Single-cell RNA-seq quantifications and analysis 部分 |
| 体外 Th2 极化 | 初始 CD4+ T 细胞分离方法、anti-CD3/CD28 浓度、IL-2/IL-4 浓度、培养时间 阅读提示：Methods 中 CD4+ T-cell isolation and culture 部分及 Figure 6E |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号及荧光素、死活染料、Fc 阻断剂、胞内染色流程 阅读提示：Methods 中 Flow cytometry 部分 |