体外CCL20诱导实验
确定S. aureus感染时CCL20的细胞来源和表达条件
培养MC3T3-E1成骨细胞、原代成骨细胞、破骨细胞和巨噬细胞（M0/M1/M2），用S. aureus USA300（MOI 1、10、50）感染24小时，或用活菌、热灭活、福尔马林灭活菌处理，ELISA检测上清中CCL20。
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CCL20/CCR6信号在金黄色葡萄球菌骨髓炎建立过程中调节疾病严重程度
CCL20/CCR6 signaling modulates disease severity during the establishment of Staphylococcus aureus osteomyelitis.
实验完整度
高包含体外细胞感染实验、基因敲除小鼠植入相关骨髓炎模型、免疫组化、流式细胞术、μCT、临床患者样本检测等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
MC3T3-E1成骨细胞 原代骨髓来源成骨细胞 骨髓来源巨噬细胞（M0/M1/M2） C57BL/6、CCL20−/−、CCR6−/−小鼠经胫骨植入物骨髓炎模型
重点核对
小鼠品系：C57BL/6、CCL20−/−、CCR6−/−，经胫骨植入物感染美国MRSA USA300 LAC::lux，细菌载量2 × 10^5 CFU 体外感染：MC3T3-E1和原代成骨细胞用S. aureus USA300以MOI 1、10、50处理24小时 巨噬细胞极化：M0用PBS、M1用IFN-γ (50 ng/mL)、M2用IL-4 (20 ng/mL)处理2小时，然后感染 体内时间点：感染后第1、3、7、10、14天监测生物发光，第14天处死并检测CFU 临床样本：培养确认的S. aureus骨髓炎患者血清（n=23）与未感染对照（n=10）血清CCL20水平
摘要
趋化因子是免疫反应的重要介质，已知CCL20/CCR6趋化因子信号轴参与炎症、感染性疾病和癌症进展。然而，CCL20/CCR6轴在宿主防御金黄色葡萄球菌骨髓炎中的作用仍不清楚。我们假设CCL20/CCR6轴对于免疫细胞针对金黄色葡萄球菌的募集和活化至关重要，并且缺乏CCL20或其单一受体CCR6会导致金黄色葡萄球菌骨髓炎加重。体外研究证实，成骨细胞和巨噬细胞（M0和M2亚型）在暴露于金黄色葡萄球菌后分泌CCL20。在C57BL/6、CCL20−/−和CCR6−/−小鼠中进行的植入物相关骨髓炎显示，在感染后第1天，CCL20−/−和CCR6−/−小鼠的浮游细菌生长早期增加，第14天软组织和骨中的细菌载量增加。免疫组织化学和流式细胞术显示，CCL20−/−和CCR6−/−小鼠感染部位T细胞（尤其是CCR6+ T细胞）的募集受损。有趣的是，CCR6−/−小鼠表现出破骨细胞数量增加、反应性骨形成和骨矿物质密度降低。在一项临床初步研究中，我们观察到金黄色葡萄球菌骨髓炎患者（n = 23）与未感染对照组（n = 10）相比，血清CCL20水平增加了五倍（P < 0.05）。值得注意的是，脓毒症死亡后立即测得的血清CCL20水平比未感染患者高100倍（P < 0.05）。总的来说，这些结果强调了CCL20/CCR6介导的宿主免疫在金黄色葡萄球菌骨髓炎建立过程中的关键作用，以及CCL20作为骨髓炎诱导的脓毒症生物标志物的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCL20/CCR6信号轴在金黄色葡萄球菌骨髓炎宿主防御和骨病理中的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- 感染时成骨细胞和巨噬细胞分泌CCL20，通过其受体CCR6募集CCR6+ T细胞至感染部位，促进细菌清除；CCR6缺失还影响骨重塑，导致破骨细胞活性增加和反应性骨形成。
- 主要证据
- 体外细胞感染实验显示成骨细胞和M0/M2巨噬细胞分泌CCL20；CCL20−/−和CCR6−/−小鼠感染后细菌载量升高、T细胞募集减少（免疫组化和流式）；CCR6−/−小鼠TRAP染色显示破骨细胞面积增加；临床样本中血清CCL20水平在感染患者中升高，脓毒症死亡患者更高。
- 研究意义
- 研究揭示了CCL20/CCR6轴在骨髓炎中的免疫调节作用，表明血清CCL20可作为骨髓炎严重程度和脓毒症死亡的潜在预后生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠植入相关骨髓炎模型建立与细菌载量分析
评估CCL20/CCR6缺失对小鼠骨髓炎严重程度的影响
在C57BL/6、CCL20−/−和CCR6−/−小鼠中植入被USA300 LAC::lux污染的胫骨植入物，监测生物发光、脓肿形成，并在第14天进行CFU定量和细胞因子分析。
免疫细胞浸润评估
检测CCL20/CCR6缺失对感染部位T细胞和巨噬细胞募集的影响
对感染胫骨切片进行免疫荧光染色（CD3、CCR6、F4/80），并利用流式细胞术分析骨髓中CD3+ T细胞、CCR6+ CD4/CD8 T细胞和巨噬细胞的数量。
骨重塑分析
评估CCL20/CCR6缺失对感染骨结构和骨转换的影响
使用μCT扫描评估骨缺损和反应性骨形成，DEXA测量骨密度，TRAP染色评估破骨细胞活性。
临床样本分析
评估S. aureus骨髓炎患者血清CCL20水平与疾病严重程度的相关性
收集健康对照、金黄色葡萄球菌骨髓炎患者和脓毒症死亡患者的血清，用Luminex assay检测CCL20水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| αMEM培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| I型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞分化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- |
| 核因子κB受体活化因子配体 | PeproTech | -- | |
| 干扰素-γ | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | -- | |
| 体外感染和ELISA检测 | 小鼠CCL20 ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 临床样本检测 | Milliplex xMAP多重检测试剂盒 | Millipore Sigma | -- |
| 体外抗菌试验 | 重组CCL20 | PeproTech | -- |
| 西他沙星 | Nanjing Chemlin Chemicals | 163253-35-8 | |
| 细胞因子分析 | Luminex 200系统 | Luminex | -- |
| μCT成像 | VivaCT40微型CT | Scanco Medical | -- |
| μCT图像处理 | Amira软件 | FEI Visualization Sciences Group | -- |
| 组织学 | VS120虚拟切片显微镜 | Olympus | -- |
| Visiopharm软件 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 山羊抗CD3-epsilon抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1127 |
| 兔抗CCL20抗体 | Bioss Antibodies | BS-1268R | |
| 兔抗CCR6抗体 | Biorbyt | orb253812 | |
| 大鼠抗小鼠F4/80抗体 | BioRad | MCA497G | |
| 生物素化大鼠抗Ly6G抗体 | Biolegend | 127604 | |
| 仓鼠抗小鼠CD11c抗体 | MyBiosource | MBS690274 | |
| Alexa Fluor 568偶联驴抗山羊IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11057 | |
| Alexa Fluor 488偶联驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | |
| FITC偶联抗叙利亚仓鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 307-096-003 | |
| Alexa Fluor 647驴抗大鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-606-153 | |
| Alexa Fluor 680偶联链霉亲和素 | Thermo Fisher Scientific | S32358 | |
| 抗原修复液 | Vector Laboratories | -- | |
| 含DAPI的Vectashield抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | OM-1200 | |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料eFluor 520 | eBioscience | 65-0867-14 |
| 抗CD45 APC-Cy7抗体 | Biolegend | 103116 | |
| 抗CD3 BV41抗体 | Biolegend | 100227 | |
| 抗CD4 BV510抗体 | BD Biosciences | 569249 | |
| 抗CD8 BUV395抗体 | BD Biosciences | 565968 | |
| 抗F4/80 PerCP抗体 | Biolegend | 123125 | |
| 抗CD86 BV650抗体 | BD Biosciences | 564200 | |
| 抗CD163 BUV615抗体 | Thermo Fisher Scientific | 366-1631-82 | |
| 抗CCR6 APC抗体 | Biolegend | 129813 | |
| Cytek Aurora五激光光谱流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| UltraComp eBeads Plus补偿微球 | Thermo Fisher Scientific | 01-3333-43 | |
| DEXA扫描 | iNSiGHT VET DXA扫描仪 | OsteoSys | -- |
| 免疫荧光图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 组织学图像分析 | Olympus OlyVIA软件 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外CCL20诱导实验 | 细胞类型、S. aureus菌株和MOI、极化条件（IFN-γ和IL-4浓度）、处理时间、ELISA试剂盒品牌 阅读提示：Materials and Methods: CCL20 in vitro induction assay; Figure 1C–F |
| 小鼠骨髓炎模型 | 小鼠品系（C57BL/6、CCL20−/−、CCR6−/−）、年龄、性别、细菌载量（2×10^5 CFU）、植入物类型、监测时间点、CFU定量方法 阅读提示：Materials and Methods: In vivo mouse model; Figure 2A |
| 免疫细胞分析 | 组织处理（脱钙、切片）、抗体克隆和稀释度、流式抗体组合、骨髓细胞分离方法、分析软件 阅读提示：Materials and Methods: Multicolor immunofluorescence staining and Single-cell suspensions and flow cytometry |
| 骨重塑评估 | μCT扫描参数（体素大小、能量、电流）、DEXA扫描条件、TRAP染色方法、图像分析软件 阅读提示：Materials and Methods: μCT imaging and analysis, DEXA scan, Histology |
| 临床样本分析 | 患者入组标准、样本量（n=10/23/5）、血清采集时间点、Luminex assay操作规程 阅读提示：Materials and Methods: Patient enrollment; Figure 6A |