重组SADS-CoV作为猪流行性腹泻疫苗开发的载体

Recombinant SADS-CoV as a vector for porcine epidemic diarrhea vaccine development.

作者信息Xiaoling Yan, Xiaoli Zhang, Xiaocheng Lyu, Yaoyao Zheng, Qianniu Li, Xiaoya Zhao, Jun Fu, Jingyun Ma
PMID40842983
发布时间2025-08-06
DOI10.3389/fimmu.2025.1633661

实验完整度

主要模型

Vero细胞 IPI-2I细胞 仔猪 怀孕母猪

重点核对

重组病毒在Vero细胞中连续传代20代后外源基因稳定 重组病毒在Vero和IPI-2I细胞中的一步生长曲线 怀孕母猪免疫剂量(2×10^6.38 TCID50/头)和免疫时间(分娩前30天和9天) 仔猪攻毒剂量(10^7.5 TCID50/头)和攻毒途径(口服) 不同重组病毒免疫组在仔猪中的腹泻评分、存活率和肠道病毒载量

摘要

Introduction: Swine acute diarrhea syndrome coronavirus (SADS-CoV) is an emerging porcine enteric coronavirus that can cause diarrhea in piglets younger than 5 days of age. However, infection of pigs older than 5 days of age does not usually result in obvious clinical symptoms. This relative intrinsic safety in older animals prompted us to investigate the potential of SADS-CoV as a viral vector for porcine diarrhea virus vaccines.Methods: We utilized Gibson assembly to clone the SADS-CoV sequence into an artificial bacterial chromosome (BAC) vector. Further manipulation was carried out by recombineering to generate four attenuated recombinant SADS-CoV strains expressing a PEDV protective antigen fused with peptides that target immune cells. Subsequently, the biological characteristics and immunogenic efficacy of these four recombinant strains were systematically assessed through in vitro cell models and in vivo animal challenge experiments.Results and discussion: The recombinant viruses exhibited a proliferation profile similar to that of the wild-type virus in Vero cells, maintained stable cytopathic effects, retained the exogenous sequences for up to 20 passages, and consistently expressed the PEDV antigen fusion protein. Immunizing pregnant sows with these recombinant viruses effectively enhanced both cellular and mucosal immune responses and provided significant clinical protection against PEDV to their offspring. This study not only generated a vaccine candidate for PEDV but also established a pipeline for using the SADS-CoV as a vector for vaccine development.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探究SADS-CoV是否可作为表达PEDV保护性抗原的病毒载体,并评估其免疫原性和保护效果。
核心机制
删除NS3a基因减弱病毒毒力,插入PEDV COE和S1D抗原及靶向M细胞和树突状细胞的肽(Co1和DCpep),增强抗原呈递和黏膜免疫反应。
主要证据
体外实验显示重组病毒在Vero细胞中增殖特性与野生型相似,稳定表达外源蛋白;动物实验显示免疫怀孕母猪后,仔猪获得被动免疫保护,攻毒后腹泻评分降低、存活率提高、肠道病毒载量减少。
研究意义
本研究为利用SADS-CoV作为载体开发猪病原体疫苗提供了新策略,并产出了PEDV疫苗候选株。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

构建SADS-CoV感染性克隆

获得SADS-CoV全长cDNA克隆以进行后续基因操作

利用Gibson组装将SADS-CoV基因组片段克隆到BAC载体,并通过Redαβ重组工程进行修饰,最终获得感染性克隆。

2

敲除NS3a基因并插入PEDV抗原

减弱病毒毒力并表达PEDV保护性抗原及靶向肽

通过Redαβ重组工程删除NS3a基因,并通过Gibson组装插入PEDV COE+S1D、Co1、DCpep等序列,构建四种重组病毒。

3

病毒拯救及生物学特性鉴定

验证重组病毒能否成功拯救并保持复制能力

将感染性克隆与辅助质粒共转染Vero细胞,观察细胞病变,通过PCR和测序确认病毒基因组正确性。

4

重组病毒传代稳定性评估

评估外源基因在病毒传代过程中的稳定性

将重组病毒在Vero细胞中连续传代至第20代,通过RT-PCR检测外源基因的存在。

5

体外生长特性分析

比较重组病毒与野生型病毒的增殖动力学

在Vero和IPI-2I细胞中测定一步生长曲线,收集不同时间点样品进行qRT-PCR定量。

6

外源蛋白表达验证

确认重组病毒能表达PEDV抗原蛋白

通过Western blot和免疫荧光检测Vero细胞中PEDV S蛋白的表达。

7

动物免疫实验

评估重组病毒在怀孕母猪中的免疫原性

通过后海穴位注射免疫怀孕母猪,在分娩时收集外周血和血清,检测免疫细胞比例和抗体水平。

8

仔猪攻毒保护实验

评估被动免疫对仔猪抵抗PEDV感染的保护效果

对7日龄仔猪口服攻毒PEDV-LN,观察临床症状、存活率、体重变化、病毒脱落和肠道病理。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
杜尔贝科改良 Eagle 培养基----
胎牛血清----
青霉素-链霉素----
AxyPrep 体液病毒 DNA/RNA 小提试剂盒Axygen--
PrimeScript™ 第一链 cDNA 合成试剂盒Takara Bio--
Gibson 组装克隆试剂盒NEB--
Lipofectamine 3000Thermo Fisher Scientific--
病毒 DNA/RNA 提取试剂盒Guangzhou Yueyang Biological Technology Co., Ltd.--
HiScript II 一步法 RT-PCR 试剂盒Vazyme--
HiScript II U+ 一步法 qRT-PCR 探针试剂盒Vazyme--
RIPA 裂解液CWBIO--
5× SDS 上样缓冲液CWBIO--
PAGE 凝胶快速制备试剂盒Epizyme--
Multi-rAb HRP-山羊抗小鼠重组二抗 (H+L)ProteintechRGAM001
Omni-ECL™ Femto 光化学发光试剂盒Epizyme--
Azure 500 成像系统----
CoraLite488 标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L)ProteintechSA00013-1
4',6-二脒基-2-苯基吲哚----
小鼠抗猪 CD3ϵ-SPRD (PPT3)SouthernBiotech--
小鼠抗猪 CD8α-AF488 (76-2-11)SouthernBiotech4520-30
CD11c/整合素 α X 多克隆抗体Proteintech17342-1-AP
CD80/B7-1 单克隆抗体Proteintech66406-1-Ig
FITC 标记的亲和纯化山羊抗兔 IgG (H+L)Boster BioBA1105
山羊抗小鼠 IgG/Alexa Fluor 488Biossbs-0296G-AF488
BD FACSCalibur 流式细胞仪BD--
PEDV IgG ELISA 试剂盒Guangzhou Yueyang Biological Technology Co., Ltd.--
PEDV IgA ELISA 试剂盒Guangzhou Yueyang Biological Technology Co., Ltd.--
Zoletil®50Virbac--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
病毒拯救与传代
Vero细胞培养条件,转染试剂Lipofectamine 3000的使用,拯救病毒的传代次数和感染复数(MOI=0.01)
阅读提示:Methods: 4.2, 4.4, 4.6, 4.7, 4.8
重组病毒免疫母猪
免疫剂量(2×10^6.38 TCID50/头),免疫途径(后海穴位注射),免疫时间(分娩前30天和9天),每组母猪数(6头)
阅读提示:Results Table 1, Methods: 4.11
仔猪攻毒保护
攻毒病毒株PEDV-LN,攻毒剂量(10^7.5 TCID50/头),攻毒途径(口服),仔猪日龄(7日龄),观察期(14天)
阅读提示:Methods: 4.11, Figure 5A
免疫学检测
流式细胞术检测CD11c, CD80, CD3+CD4+, CD3+CD8+细胞比例,ELISA检测IgG和IgA抗体水平
阅读提示:Methods: 4.12, 4.13
组织病理学分析
H&E染色和IHC检测PEDV S蛋白,肠道组织采样时间(攻毒后第8天)
阅读提示:Methods: 4.16, 4.17, Figure 6