构建SADS-CoV感染性克隆
获得SADS-CoV全长cDNA克隆以进行后续基因操作
利用Gibson组装将SADS-CoV基因组片段克隆到BAC载体,并通过Redαβ重组工程进行修饰,最终获得感染性克隆。
Recombinant SADS-CoV as a vector for porcine epidemic diarrhea vaccine development.
Vero细胞 IPI-2I细胞 仔猪 怀孕母猪
重组病毒在Vero细胞中连续传代20代后外源基因稳定 重组病毒在Vero和IPI-2I细胞中的一步生长曲线 怀孕母猪免疫剂量(2×10^6.38 TCID50/头)和免疫时间(分娩前30天和9天) 仔猪攻毒剂量(10^7.5 TCID50/头)和攻毒途径(口服) 不同重组病毒免疫组在仔猪中的腹泻评分、存活率和肠道病毒载量
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得SADS-CoV全长cDNA克隆以进行后续基因操作
利用Gibson组装将SADS-CoV基因组片段克隆到BAC载体,并通过Redαβ重组工程进行修饰,最终获得感染性克隆。
减弱病毒毒力并表达PEDV保护性抗原及靶向肽
通过Redαβ重组工程删除NS3a基因,并通过Gibson组装插入PEDV COE+S1D、Co1、DCpep等序列,构建四种重组病毒。
验证重组病毒能否成功拯救并保持复制能力
将感染性克隆与辅助质粒共转染Vero细胞,观察细胞病变,通过PCR和测序确认病毒基因组正确性。
评估外源基因在病毒传代过程中的稳定性
将重组病毒在Vero细胞中连续传代至第20代,通过RT-PCR检测外源基因的存在。
比较重组病毒与野生型病毒的增殖动力学
在Vero和IPI-2I细胞中测定一步生长曲线,收集不同时间点样品进行qRT-PCR定量。
确认重组病毒能表达PEDV抗原蛋白
通过Western blot和免疫荧光检测Vero细胞中PEDV S蛋白的表达。
评估重组病毒在怀孕母猪中的免疫原性
通过后海穴位注射免疫怀孕母猪,在分娩时收集外周血和血清,检测免疫细胞比例和抗体水平。
评估被动免疫对仔猪抵抗PEDV感染的保护效果
对7日龄仔猪口服攻毒PEDV-LN,观察临床症状、存活率、体重变化、病毒脱落和肠道病理。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒拯救与传代 | Vero细胞培养条件,转染试剂Lipofectamine 3000的使用,拯救病毒的传代次数和感染复数(MOI=0.01) 阅读提示:Methods: 4.2, 4.4, 4.6, 4.7, 4.8 |
| 重组病毒免疫母猪 | 免疫剂量(2×10^6.38 TCID50/头),免疫途径(后海穴位注射),免疫时间(分娩前30天和9天),每组母猪数(6头) 阅读提示:Results Table 1, Methods: 4.11 |
| 仔猪攻毒保护 | 攻毒病毒株PEDV-LN,攻毒剂量(10^7.5 TCID50/头),攻毒途径(口服),仔猪日龄(7日龄),观察期(14天) 阅读提示:Methods: 4.11, Figure 5A |
| 免疫学检测 | 流式细胞术检测CD11c, CD80, CD3+CD4+, CD3+CD8+细胞比例,ELISA检测IgG和IgA抗体水平 阅读提示:Methods: 4.12, 4.13 |
| 组织病理学分析 | H&E染色和IHC检测PEDV S蛋白,肠道组织采样时间(攻毒后第8天) 阅读提示:Methods: 4.16, 4.17, Figure 6 |