JPZS成分分析
鉴定JPZS的主要化学成分，确保批次一致性。
采用HPLC-MS对JPZS样品进行成分分析，检测到多种活性成分。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
健脾滋肾方通过调节DNMT1介导的Foxp3甲基化促进MRL/lpr小鼠Treg/Th17平衡
Promotion of Treg/Th17 balance in MRL/lpr mice by Jianpi-Zishen Formula via modulation of DNMT1-mediated Foxp3 methylation.
实验完整度
高包含体内动物模型（MRL/lpr小鼠）及体外细胞实验（CD4+ T细胞），并涉及表观遗传机制验证（DNA甲基化、DNMT活性）及功能验证（Treg/Th17比例、细胞因子）。
主要模型
MRL/lpr小鼠SLE模型 C57BL/6小鼠健康对照 小鼠脾脏CD4+ T细胞
重点核对
JPZS给药剂量：低剂量6.305 g/kg，中剂量12.61 g/kg，高剂量25.22 g/kg，灌胃，每日一次，持续8周 5-aza-CdR剂量：0.2 mg/mL，200 µL腹腔注射，每2天1次，从第5周开始持续4周 DC_517剂量：1.7 μM，200 µL腹腔注射，每2天1次，从第5周开始持续4周 动物分组：MRL/lpr小鼠随机分为6组，每组8只；C57BL/6小鼠8只为健康对照 检测指标：Foxp3-TSDR甲基化水平（10个CpG位点）、DNMT1酶活性、Foxp3和Dnmt1 mRNA表达、Treg/Th17细胞比例、血清细胞因子和自身抗体水平
摘要
目的：本研究旨在探讨健脾滋肾方（JPZS）是否通过调节DNA甲基转移酶1（DNMT1）介导的叉头框蛋白P3（Foxp3）甲基化来调节MRL/lpr小鼠的Treg/Th17平衡，并阐明其改善系统性红斑狼疮（SLE）免疫稳态的潜在机制。方法：将48只雌性MRL/lpr小鼠随机分为六组（每组n=8）：JPZS（低/中/高剂量）、5-aza-CdR（DNMT抑制剂）、DC_517（DNMT1抑制剂）和模型对照。8只C57BL/6小鼠作为健康对照。小鼠接受相应干预措施八周。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和血清生化参数评估JPZS对MRL/lpr小鼠疾病进展的影响。此外，采用免疫荧光染色和流式细胞术研究Treg和Th17细胞比例的变化。从小鼠脾脏分离CD4+ T细胞用于后续研究，包括实时定量PCR、蛋白质印迹和DNA甲基化水平测定。此外，使用EpiQuik DNMT检测试剂盒定量CD4+ T细胞特异性DNA甲基转移酶的酶活性。结果：JPZS以剂量依赖性方式显著改善MRL/lpr小鼠的疾病发展。流式细胞术和免疫荧光表明JPZS促进Treg/Th17再平衡。研究发现，模型组CD4+ T细胞中Foxp3甲基化水平较高，Foxp3 mRNA转录水平下调；JPZS可下调模型组CD4+ T细胞的Foxp3甲基化水平。进一步研究发现，Foxp3甲基化水平与Dnmt1酶活性密切相关，JPZS可下调Dnmt1酶活性，从而上调Foxp3 mRNA转录水平。结论：JPZS可能通过DNMT1调节的Foxp3去甲基化恢复SLE中的Treg/Th17平衡，提示其免疫调节作用的表观遗传机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- JPZS是否通过调节DNMT1介导的Foxp3甲基化来恢复MRL/lpr小鼠的Treg/Th17平衡？
- 核心机制
- JPZS通过抑制DNMT1酶活性和蛋白表达，降低Foxp3-TSDR区域甲基化，上调Foxp3 mRNA表达，从而恢复Treg/Th17平衡。
- 主要证据
- 在MRL/lpr小鼠模型中，JPZS治疗降低了Dnmt1活性和Foxp3-TSDR甲基化，增加了Foxp3表达和Treg比例，减少了Th17比例，并改善了疾病指标（降低dsDNA、IgG、炎症因子，升高C3）。DNMT1抑制剂DC_517模拟了类似效果。
- 研究意义
- 该研究揭示了JPZS通过DNMT1-Foxp3轴调节Treg/Th17平衡的表观遗传机制，为SLE的治疗提供了科学依据，并提示DNMT1可作为自身免疫病表观遗传干预的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
动物分组与给药
评估JPZS对MRL/lpr小鼠疾病进展的影响。
48只MRL/lpr小鼠随机分为6组（每组8只）：模型组、JPZS低/中/高剂量组、5-aza-CdR组、DC_517组，8只C57BL/6小鼠作为健康对照。各组给予相应干预，持续8周。
疾病指标检测
评估JPZS对MRL/lpr小鼠疾病严重程度的影响。
通过ELISA检测血清中细胞因子（TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-23）、dsDNA抗体、IgG和C3水平，并计算脾脏指数。
Treg/Th17细胞比例检测
评估JPZS对Treg和Th17细胞亚群的影响。
采用流式细胞术和免疫荧光检测脾脏和外周血中Treg和Th17细胞比例。
CD4+ T细胞分离
获取CD4+ T细胞用于后续分子机制研究。
从小鼠脾脏制备单细胞悬液，采用磁珠分选（MACS）负选法分离CD4+ T细胞。
DNA甲基化分析
检测Foxp3-TSDR区域甲基化水平。
提取CD4+ T细胞基因组DNA，亚硫酸盐转化后，通过靶向测序定量Foxp3-TSDR区域10个CpG位点的甲基化水平。
基因表达检测
检测Foxp3、RORγt、Dnmt1 mRNA表达水平。
提取CD4+ T细胞总RNA，逆转录后进行qPCR检测。
蛋白表达检测
检测DNMT1蛋白表达水平。
提取CD4+ T细胞总蛋白，通过Western blot检测DNMT1蛋白表达。
DNMT酶活性检测
检测Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B酶活性。
提取CD4+ T细胞核蛋白，使用EpiQuik DNMT检测试剂盒测定酶活性。
功能验证与机制关联
验证JPZS通过抑制DNMT1介导的Foxp3甲基化促进Treg/Th17平衡。
比较JPZS和DC_517（DNMT1抑制剂）对细胞比例、基因表达、血清细胞因子和疾病指标的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| JPZS制备和质量控制 | Shim-pack GIST C18色谱柱 | -- | -- |
| JPZS成分分析标准品 | 儿茶素 | 上海源叶生物科技有限公司 | B21722 |
| 没食子酸 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20851 | |
| 5-羟甲基糠醛 | 上海源叶生物科技有限公司 | B21382 | |
| 毛蕊花糖苷 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20715 | |
| 芦丁 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20711 | |
| 金丝桃苷 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20631 | |
| 槲皮素 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20257 | |
| 椴树苷 | 上海源叶生物科技有限公司 | B21587 | |
| 山柰酚 | 上海源叶生物科技有限公司 | B21126 | |
| 芒柄花素 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20836 | |
| 苍术内酯III | 上海源叶生物科技有限公司 | B20056 | |
| 黄芪甲苷A | 上海源叶生物科技有限公司 | B20564 | |
| 薯蓣皂苷 | 上海源叶生物科技有限公司 | B1176 | |
| 苍术素 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20128 | |
| 茯苓酸 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20400 | |
| 苍术酮 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20129 | |
| 动物实验 | MRL/lpr小鼠 | 上海斯莱克实验动物有限责任公司 | -- |
| C57BL/6小鼠 | 上海斯莱克实验动物有限责任公司 | -- | |
| 5-氮杂-2-脱氧胞苷 | Selleck | S1200 | |
| DC_517 | MCE | HY-A0004 | |
| 流式细胞术 | CD4抗体 | BioLegend | 100510 |
| IL-17A抗体 | BioLegend | 506903 | |
| CD25抗体 | BioLegend | 102027 | |
| Foxp3抗体 | BioLegend | 320011 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | Brea, CytoFLEX, USA | |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| CD4+ T细胞分离 | MACS CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-104-454 |
| DNA甲基化分析 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen Biotech | DP304 |
| EZ DNA甲基化金试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| Illumina HiSeq 2500测序平台 | Illumina | -- | |
| RNA提取与qPCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596018 |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TaKaRa | RR047A | |
| Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒 | Novoprotein | E096-01B | |
| PikoReal PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P00150 | |
| SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 | Beyotime | PG111 | |
| Dnmt1抗体 | Bioss Inc | bs-0678R | |
| HRP标记二抗 | Zsbio | -- | |
| GAPDH抗体 | Zsbio | -- | |
| ECL检测试剂盒 | Thermo | 340958 | |
| ELISA | IL-17 ELISA试剂盒 | 武汉金迈生物科技有限公司 | JYM0554Mo |
| IL-23 ELISA试剂盒 | 武汉金迈生物科技有限公司 | JYM0394Mo | |
| TGF-β1 ELISA试剂盒 | 武汉金迈生物科技有限公司 | JYM0215Mo | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | 武汉金迈生物科技有限公司 | JYM0540Mo | |
| 抗dsDNA ELISA试剂盒 | 武汉金迈生物科技有限公司 | JYM1061Mo | |
| IgG ELISA试剂盒 | 武汉金迈生物科技有限公司 | JYM0031Mo | |
| C3 ELISA试剂盒 | 武汉金迈生物科技有限公司 | JYM0293Mo | |
| 酶标仪 | Rayto | RT-6000, China | |
| DNMT酶活性检测 | 核蛋白提取试剂盒 | Epigentek | -- |
| EpiQuik DNMT检测试剂盒 | Epigentek | -- | |
| 免疫荧光 | 抗FOXP3抗体 | Santa Cruz | sc-53876 |
| 抗IL-17A抗体 | Bioss | bs-2140R | |
| 全景MIDI扫描仪 | 3DHISTECH | -- | |
| 统计分析 | IBM SPSS软件 | IBM | version 26.0 |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物分组与给药 | MRL/lpr小鼠随机分组数量（每组8只），C57BL/6健康对照，JPZS低中高剂量（6.305、12.61、25.22 g/kg），给药方式（灌胃）和频率（每日一次）及持续时间（8周）；5-aza-CdR和DC_517剂量与给药方式（腹腔注射，每2天一次，从第5周开始持续4周）；对照组给予等量生理盐水。 阅读提示：Materials and methods: Animals and experimental design |
| 疾病指标检测 | 血清样本采集时间（第8周），ELISA检测TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-23、dsDNA、IgG、C3，脾脏指数计算。 阅读提示：Results: JPZS improves disease development in MRL/lpr mice; Methods: Detection of dsDNA, complement 3 (C3), cytokine and enzyme concentrations |
| Treg/Th17细胞比例检测 | 流式细胞术检测外周血和脾脏中Th17（CD4+IL-17A+）和Treg（CD4+CD25+Foxp3+）细胞比例，抗体克隆和荧光标记，免疫荧光检测脾脏FOXP3/IL-17A。 阅读提示：Methods: Flow cytometry assay; Immunofluorescence; Figure 3 |
| CD4+ T细胞分离 | 脾脏单细胞悬液制备，MACS负选法分离CD4+ T细胞，试剂盒品牌和货号（Miltenyi, 130-104-454）。 阅读提示：Methods: Extraction of CD4+ T cells from mouse spleen |
| Foxp3甲基化分析 | CD4+ T细胞基因组DNA提取，亚硫酸盐转化，靶向测序定量Foxp3-TSDR区域10个CpG位点甲基化水平；各组样本量（Control n=4，Model和JPZS n=8，5-aza-CdR和DC_517 n=5）。 阅读提示：Methods: DNA extraction and DNA methylation analysis; Results: DNMT1-mediated Foxp3-TSDR methylation and JPZS reduction; Figure 4 |
| 基因表达检测 | qPCR检测Foxp3、RORγt、Dnmt1 mRNA表达，内参β-actin，引物序列，RNA提取和逆转录试剂盒。 阅读提示：Methods: Total RNA isolation and qPCR |
| DNMT1蛋白表达检测 | Western blot检测DNMT1蛋白表达，抗体和稀释比例（Dnmt1 1:1000，GAPDH 1:5000），蛋白提取和定量方法。 阅读提示：Methods: Total cell protein extraction and western blotting assay |
| DNMT酶活性检测 | 提取CD4+ T细胞核蛋白，使用EpiQuik DNMT assay kit测定Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B酶活性。 阅读提示：Methods: Detection of dsDNA, complement 3 (C3), cytokine and enzyme concentrations |