瞬时转染生产VLPs
验证密码子优化基因提高结构蛋白表达和VLPs产量，并评估其免疫原性。
HEK293T细胞共转染编码密码子优化的S、M、N、E的质粒，生产VLPs，纯化后进行TEM成像和小鼠免疫。
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通过诱导型E和M蛋白表达在稳定细胞系中生产SARS-CoV-2病毒样颗粒作为疫苗候选
Production of SARS-CoV-2 virus-like particles as a vaccine candidate in stable cell lines through inducible E and M protein expression.
实验完整度
高包含细胞转染、稳定细胞系建立、VLPs生产与纯化、免疫电镜、小鼠免疫及ELISA检测等多个独立证据层级，并有功能验证。
主要模型
HEK293T细胞系 BALB/c小鼠 SARS-CoV-2 VLPs
重点核对
HEK293T细胞（ATCC CRL-3216） 诱饵质粒pTetcoM-coN-BSD和pTetcoE-coS-Puro 1 μg/mL doxycycline诱导 选择抗生素：15 μg/mL blasticidin和1 μg/mL puromycin 小鼠免疫剂量：3 μg VLP与铝佐剂
摘要
病毒样颗粒（VLPs）提供了潜在的高免疫原性/低成本疫苗平台。SARS-CoV-2 VLPs的生产是通过瞬时转染编码病毒结构蛋白的基因实现的，但成本高且难以放大。为了解决这个问题，稳定的VLPs生产细胞系是可取的。在本研究中，我们通过优化密码子的S、M、N和E基因的四个质粒瞬时转染HEK293T细胞，实现了高效的VLPs生产。此外，在小鼠中引发了刺突特异性IgG抗体，但在检测的时间点未检测到显著的中和活性。透射电子显微镜（TEM）显示VLPs直径约为120 nm。然而，E或M蛋白的过表达对细胞有毒性。通过构建两个质粒建立稳定细胞系，其中E和M的表达由诱导型Tet-on启动子控制，它们分别与S和N相邻。通过用两种抗生素嘌呤霉素和杀稻瘟菌素共同选择，建立了稳定表达SARS-CoV-2 VLPs的HEK293T细胞系。在接种了用铝佐剂配制的VLPs的小鼠中检测到针对S蛋白的特异性IgG抗体。我们的研究结果为大规模生产SARS-CoV-2 VLPs作为疫苗候选提供了有效方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立稳定、可放大的哺乳动物细胞平台用于生产SARS-CoV-2 VLPs，同时避免结构蛋白过表达的细胞毒性？
- 核心机制
- M和E蛋白的过表达诱导细胞毒性，通过Tet-on诱导系统严格控制其表达，可维持细胞活力并实现VLPs的稳定生产。
- 主要证据
- M和E蛋白过表达导致HEK293T细胞死亡，而Tet-on系统在无doxycycline时抑制表达，有doxycycline时诱导表达并产生VLPs，TEM确认约120 nm的颗粒，小鼠免疫后检测到刺突特异性IgG。
- 研究意义
- 该平台可实现大规模、可控的VLPs生产，减少瞬时转染的变异性，为SARS-CoV-2及其变异株和未来疫情提供快速、灵活的疫苗候选。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估M和E蛋白过表达的细胞毒性
确定结构蛋白过表达对细胞活力的影响，为稳定细胞系设计提供依据。
单独转染编码密码子优化的S、M、N、E的质粒，在24和48小时通过台盼蓝染色检测细胞活力，并观察细胞形态。
构建Tet-on诱导质粒并验证可控表达
验证Tet-on系统能否调控M和E蛋白的表达，避免细胞毒性。
构建pTetcoM-BSD和pTetcoE-Puro质粒，转染HEK293T细胞，使用doxycycline诱导，通过Western blot检测蛋白表达，并检测细胞活力。
构建多基因共表达质粒
实现两个结构基因在同一质粒中的表达，简化转染和稳定细胞系构建。
构建pTetcoM-coN-BSD和pTetcoE-coS-Puro质粒，转染HEK293T细胞，验证在doxycycline诱导下四蛋白的表达和细胞活力。
建立稳定细胞系并验证VLPs生产
通过双重抗生素筛选获得稳定表达四结构蛋白的细胞克隆，并验证其生产VLPs的能力。
共转染两个多基因质粒，用puromycin和blasticidin双重筛选，分离单细胞克隆并扩增，诱导表达后纯化VLPs，进行Western blot和TEM分析。
小鼠免疫评价
评估稳定细胞系生产的VLPs的免疫原性。
BALB/c小鼠肌肉注射3 μg VLPs加铝佐剂，两次免疫，收集血清检测刺突特异性IgG抗体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Pan-Biotech | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| Dulbecco's磷酸盐缓冲液 | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | 台盼蓝溶液 | Sangon Biotech | -- |
| 转染 | PolyJet转染试剂 | SignaGen Laboratories | -- |
| 稳定细胞系筛选 | 嘌呤霉素 | Sangon Biotech | -- |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | -- | |
| 诱导表达 | 多西环素 | -- | -- |
| VLPs定量 | S蛋白标准品 | Novoprotein | -- |
| M蛋白标准品 | Novoprotein | -- | |
| E蛋白标准品 | Novoprotein | -- | |
| N蛋白标准品 | General Biosystems | -- | |
| Western blot | 抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体 | Sino Biological | -- |
| 抗核衣壳蛋白抗体 | Bioss | -- | |
| 抗膜蛋白抗体 | HuaBio | -- | |
| 抗SARS-CoV包膜蛋白抗体 | Abcepta | -- | |
| 抗兔IgG | Abbkine | -- | |
| 抗小鼠IgG | Abbkine | -- | |
| 化学发光试剂盒 | NCM biotech | -- | |
| TEM分析 | 磷钨酸 | -- | -- |
| 透射电子显微镜 | JEOL | -- | |
| ELISA | 重组SARS-CoV-2 S三聚体抗原 | Novoprotein | -- |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Abbkine | -- | |
| 中和试验 | VSV假病毒 | -- | -- |
| Vero细胞 | -- | -- | |
| 数据读取 | Ensight微孔板读取仪 | PerkinElmer | -- |
| 细胞计数 | Countstar IC1000细胞计数仪 | ALIT Life Science | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和转染 | HEK293T细胞来源（ATCC CRL-3216），培养基和FBS，转染方法，质粒剂量 阅读提示：见Methods中的'Cell culture'和'Plasmid construction' |
| 稳定细胞系建立 | 筛选抗生素浓度（1 μg/mL puromycin, 15 μg/mL blasticidin），转染后筛选时间 阅读提示：见Methods中的'Establishment of stable cell lines' |
| 诱导表达 | Doxycycline浓度（1 μg/mL），诱导时间（48小时） 阅读提示：见Methods中的'Establishment of stable cell lines'和'Production and purification of VLPs' |
| VLPs生产与纯化 | 细胞密度，培养体积，收集时间，离心和过滤条件 阅读提示：见Methods中的'Production and purification of VLPs' |
| 小鼠免疫 | 小鼠品系、年龄、性别，免疫剂量，佐剂类型和剂量，免疫时间表 阅读提示：见Methods中的'Mouse immunization' |