病毒制备与动物感染
建立ASFV HLJ/18株感染的仔猪模型，并确定感染剂量。
使用原代猪肺泡巨噬细胞扩增病毒，HAD50法测定滴度，以103 HAD50/仔猪剂量经口鼻接种SPF仔猪，对照组接种PBS。
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从出血到凋亡：理解ASFV对仔猪的破坏性影响
From hemorrhage to apoptosis: understanding the devastating impact of ASFV on piglets.
实验完整度
高包含动物感染实验、组织病理学、IHC、TUNEL、IFA和MSB染色等多层次验证，涉及体外病毒滴定和体内多器官分析。
主要模型
SPF仔猪（ASFV HLJ/18感染模型）
重点核对
ASFV HLJ/18株感染剂量103 HAD50/仔猪 感染后10天内采集组织样本 使用IHC检测ASFV p30蛋白分布 使用TUNEL检测凋亡细胞 使用MSB染色检测纤维蛋白
摘要
非洲猪瘟（ASF）是一种毁灭性的猪传染病，对全球养猪业构成严重威胁。自2018年在中国首次报道ASF以来，该病在中国造成了巨大的经济损失。为了表征ASF病毒（ASFV）在猪体内诱导的组织病理学变化并阐明其致病机制，本研究使用ASFV HLJ/18株感染无特定病原体仔猪。在感染后第十天内采集胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结、心脏、肝脏、肺和肾脏，用于组织病理学、免疫组织化学（IHC）、TdT介导的dUTP缺口末端标记和Martius Scarlet Blue染色检测。结果显示，ASFV广泛分布于各器官。所有检查器官均观察到出血、细胞变性和坏死，同时免疫器官中淋巴细胞显著减少，并伴有大量坏死和凋亡细胞。间接免疫荧光测定和IHC进一步表明，ASFV可以感染单核细胞和巨噬细胞、上皮细胞和肝细胞。凋亡显著可见，特别是在免疫器官中的淋巴细胞中，但值得注意的是，ASFV诱导了许多不同细胞类型（除淋巴细胞外）的凋亡。此外，在多个组织的血管中观察到纤维蛋白，这可能与弥散性血管内凝血有关。这些结果表明，ASFV HLJ/18株对仔猪具有高度致病性，导致严重的病理损伤。本研究为深入分析ASFV的致病机制提供了有价值的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ASFV HLJ/18株感染仔猪后，其在体内的组织嗜性、病理损伤特征和致病机制是什么？
- 核心机制
- ASFV感染巨噬细胞等免疫细胞，诱导细胞凋亡和坏死，导致免疫器官淋巴细胞减少及免疫抑制；同时引起多器官出血和弥散性血管内凝血（DIC），加剧组织损伤。
- 主要证据
- 通过IHC和IFA显示病毒广泛分布于多器官，主要感染巨噬细胞等；TUNEL和形态学分析显示免疫器官及多种实质细胞凋亡；MSB染色显示血管内纤维蛋白沉积和透明血栓形成。
- 研究意义
- 本研究为ASFV的病理学诊断提供了参考，并为不同ASFV株的组织致病性研究提供了模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织病理学分析
评估ASFV感染后各器官的病理学变化。
感染后10天内收集9个器官（胸腺、骨髓、脾、扁桃体、淋巴结、心、肝、肺、肾），固定、包埋、切片，HE染色观察。
病毒分布检测
确定ASFV在各器官中的分布和感染的细胞类型。
使用IHC检测ASFV p30蛋白，通过IFA和双荧光标记检测胸腺中病毒与巨噬细胞、上皮细胞和T淋巴细胞的共定位。
凋亡检测
验证ASFV感染是否诱导组织细胞凋亡，并鉴定凋亡细胞类型。
使用TUNEL法检测各器官凋亡细胞，并通过双IFA检测胸腺中凋亡细胞与巨噬细胞、上皮细胞和T淋巴细胞的共定位，同时进行ASFV和TUNEL双染。
纤维蛋白沉积检测
验证ASFV感染后血管内纤维蛋白沉积和血栓形成。
使用MSB染色检测多器官（胸腺、脾、肝、肺、肾）血管中的纤维蛋白和透明血栓。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 小鼠抗猪CD3ɛ偶联AF488单克隆抗体 | Southern Biotech | -- |
| 小鼠抗猪CD3ɛ偶联SPRD单克隆抗体 | Southern Biotech | -- | |
| 小鼠抗猪CD14偶联FITC抗体 | Bio-Rad | -- | |
| 兔抗p-CK抗体 | Bioss | -- | |
| 小鼠抗ASFV p72/p30单克隆抗体 | -- | -- | |
| 免疫组织化学/免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG（H+L） | Beyotime | -- |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG-FITC | Southern Biotech | -- |
| 山羊抗小鼠IgG-TRITC | Southern Biotech | -- | |
| 山羊抗兔IgG-FITC | Southern Biotech | -- | |
| 凋亡检测 | 原位细胞死亡检测试剂盒，POD | Roche | -- |
| 原位细胞死亡检测试剂盒，TMR Red | Roche | -- | |
| 血栓检测 | MSB试剂盒 | Solarbio | -- |
| 细胞核染色 | DAPI | Sigma Aldrich | -- |
| 显微镜 | 尼康显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒制备与滴定 | 病毒株ASFV HLJ/18，感染剂量103 HAD50/仔猪，HAD50测定方法 阅读提示：Materials and Methods: Virus and animals |
| 动物感染 | SPF仔猪8周龄，体重约6kg，感染途径（文中未明确说明），对照组PBS 阅读提示：Materials and Methods: Virus and animals, Animal experiments |
| 组织采集 | 感染后10天内采集组织（胸腺、骨髓、脾、扁桃体、淋巴结、心、肝、肺、肾） 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments |
| 免疫组织化学 | ASFV p30抗体稀释度1:20，抗原修复条件（微波20分钟、0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0） 阅读提示：Materials and Methods: Histopathological and IHC analyses |
| TUNEL检测 | 蛋白酶K浓度20 µg/mL，TUNEL试剂盒（Roche） 阅读提示：Materials and Methods: TUNEL |