数据下载与核心SRG筛选
识别与HCC表型相关的关键干性相关基因
从TCGA数据库获取50例正常肝组织和374例HCC组织的转录组数据及临床信息，对4419个SRG进行差异表达分析（|log2FC|>1，p<0.05），并结合WGCNA（软阈值7，R²=0.9）鉴定与HCC表型相关的关键模块，最终获得1004个重要干性相关基因。
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新型干性相关评分：增强肝细胞癌预后和肿瘤免疫微环境的预测
Novel Stemness-Associated Scores: Enhancing Predictions of Hepatocellular Carcinoma Prognosis and Tumor Immune Microenvironment.
实验完整度
中包含生物信息学建模（TCGA/ICGC）、临床样本验证（qRT-PCR、IHC）及体外功能实验（CCK8、Transwell、克隆形成、成球实验），但缺乏体内动物实验验证。
主要模型
HCC细胞系HCCLM3和HepG2 HCC患者组织样本（40例新鲜组织，76例组织芯片） TCGA-LIHC和ICGC-LIHC队列
重点核对
SRS模型包含四个基因（EIF2B4、CDCA8、TCOF1、TOMM40L），系数分别为0.093、0.069、0.108、0.077 TCGA-LIHC队列中SRS的1年、3年、5年AUC分别为0.768、0.706、0.668 TOMM40L在HCC组织中的mRNA和蛋白水平显著高于癌旁组织 敲低TOMM40L（siTOMM40L-1和siTOMM40L-2）抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭和成球能力 细胞实验重复数：CCK8（n=5），Transwell、克隆形成和成球实验（n=3）
摘要
目的：本研究旨在利用干性相关基因（SRGs）开发肝细胞癌（HCC）的预后模型，同时确定并验证与该过程相关的关键基因。方法：利用TCGA和ICGC数据库，通过WGCNA和机器学习相结合，构建HCC的预后干性相关评分（SRS）。生物信息学分析评估了不同SRS亚组中的肿瘤免疫浸润特征和药物敏感性，并确定了关键基因TOMM40L。采用qRT-PCR和IHC检测TOMM40L的表达水平。Kaplan-Meier生存分析评估TOMM40L在HCC中的预后价值。体外细胞实验探讨了TOMM40L对HCC细胞进展和干性的影响。结果：开发并验证了包含四个SRGs（EIF2B4、CDCA8、TCOF1和TOMM40L）的HCC预后模型SRS。在不同SRS亚组中观察到肿瘤免疫浸润谱和药物敏感性的显著差异。与相邻组织相比，恶性组织中TOMM40L水平显著升高，且TOMM40L表达升高与不良预后相关。此外，敲低TOMM40L可显著抑制细胞进展和干性。结论：新构建的SRS模型是评估HCC预后的潜在生物标志物，关键基因TOMM40L具有致癌特性。关键词：肝细胞癌（HCC），干性，预后模型，机器学习，TOMM40L，体外实验
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 干性相关基因在肝细胞癌中的整体意义及其预后预测价值如何，关键基因TOMM40L是否具有致癌作用？
- 核心机制
- SRS模型中的关键基因TOMM40L可能通过影响线粒体活性参与HCC疾病进展，但其具体分子机制尚不明确。
- 主要证据
- 基于TCGA和ICGC队列构建并验证了SRS预后模型；临床样本中TOMM40L mRNA和蛋白水平显著升高，且与不良预后相关；体外实验证实敲低TOMM40L抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭和干性。
- 研究意义
- SRS模型为HCC预后评估提供了新的途径，并为个性化临床干预提供见解；TOMM40L可能成为HCC治疗靶点，未来靶向TOMM40L的纳米RNA疗法将为HCC治疗提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预后模型的构建与验证
构建并验证基于SRG的HCC预后模型SRS
对1004个基因进行随机森林筛选（重要性评分>1）获得34个基因，经单因素Cox回归得到29个预后相关基因；通过LASSO和多因素Cox回归构建包含EIF2B4、CDCA8、TCOF1和TOMM40L的SRS模型，并在TCGA和ICGC队列中评估其预测效能。
免疫微环境与药物敏感性分析
评估不同SRS亚组中的免疫浸润特征、体细胞突变谱及药物敏感性差异
采用ssGSEA算法评估22种免疫细胞浸润水平，分析HLA分子和免疫检查点分子的相关性，使用maftools探索体细胞突变谱，并通过oncoPredict预测8种常见药物的IC50值。
关键基因TOMM40L的鉴定与临床验证
鉴定SRS模型中的关键基因并验证其表达和预后价值
基于GEO数据集（GSE39791和GSE62232）比较模型基因表达变化，确定TOMM40L为关键基因；采用qRT-PCR检测40例HCC新鲜组织中TOMM40L mRNA水平，采用IHC检测组织芯片中90例HCC和90例癌旁组织的蛋白水平，并分析其与临床病理特征及生存预后的关系。
TOMM40L的体外功能实验
探讨TOMM40L对HCC细胞恶性表型和干性的影响
在HCCLM3和HepG2细胞中敲低TOMM40L（siTOMM40L-1和siTOMM40L-2），通过CCK8、克隆形成、Transwell和成球实验评估细胞增殖、迁移、侵袭和成球能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
分析免疫微环境
评估药物敏感性
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 逆转录 | TAKARA逆转录试剂盒 | Takara Bio | RR036A |
| RT-qPCR | TB-Green荧光定量PCR | Takara Bio | RR420A |
| 免疫组织化学 | TOMM40L抗体 | Bioss | bs-17317R |
| 二抗 | Bioss | bs-0312R | |
| DAB显色液 | ThermoFisher Scientific | 34002 | |
| 数字切片扫描系统 | KFBIO | KF-PRO-020-HI | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | 11965092 |
| 胎牛血清 | Invitrogen | A5670701 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| 成球实验 | DMEM/F-12培养基 | Invitrogen | 11320033 |
| B27添加剂 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| 重组人表皮生长因子 | ThermoFisher Scientific | AF-100-15-500UG | |
| 重组人成纤维细胞生长因子 | ThermoFisher Scientific | 100-18B-50UG | |
| N2添加剂 | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| CCK8实验 | CCK8试剂 | Bioogenetech | RK001099 |
| 酶标仪 | Biotek | ELX800 | |
| Transwell实验 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 成球实验 | 显微镜 | Leica | DM6B |
| 细胞转染 | 小干扰RNA | Polyplus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 预后模型构建 | SRS模型公式：SRS = (EIF2B4表达量×0.093) + (CDCA8表达量×0.069) + (TCOF1表达量×0.108) + (TOMM40L表达量×0.077)；分组：根据中位风险评分分为高SRS组和低SRS组 阅读提示：参见 Methods 2.2 节 |
| qRT-PCR检测 | 样本：40例HCC新鲜组织；内参：β-actin；引物序列：β-actin forward CACCATTGGCAATGAGCGGTTC, reverse AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT；TOMM40L forward TGGCGAGTATCGGGGAGATG, reverse CTCCCTTAGTCCACAGCCAC 阅读提示：参见 Methods 2.7 节 |
| 免疫组织化学 | 组织芯片：90例HCC和90例癌旁组织；抗体：TOMM40L抗体（Bioss bs-17317R）1:100稀释；抗原修复：0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）100°C；显色：DAB；评分：IRS≤4为低表达，>4为高表达 阅读提示：参见 Methods 2.8 节 |
| 细胞体外实验 | 细胞系：HCCLM3和HepG2；siRNA序列：siTOMM40L-1和siTOMM40L-2（见表1）；CCK8：1×10³细胞/孔，n=5；Transwell：5×10⁴细胞/孔，n=3；克隆形成：1×10³细胞/孔，培养12天，n=3；成球实验：500细胞/孔，培养5天，n=3 阅读提示：参见 Methods 2.9-2.12 节及表1 |