全转录组测序
获取原发组、转移组和对照组的mRNA、miRNA和lncRNA表达谱，以识别差异表达基因。
从5例转移性OSCC、5例原发性OSCC和5例癌旁组织中提取RNA，构建miRNA文库（SE50）和lncRNA文库（PE150），在Illumina Novaseq 6000平台测序。
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通过全转录组测序和生物信息学分析鉴定口腔鳞状细胞癌的新生物标志物
Identification of novel biomarkers involved in oral squamous cell carcinoma by whole transcriptome sequencing and bioinformatics analysis.
实验完整度
中研究包含全转录组测序、生物信息学分析、qRT-PCR和免疫组化验证，但缺乏动物模型和功能实验，属于中等完整性。
主要模型
口腔鳞状细胞癌组织样本（原发组、转移组、对照组） TCGA-OSCC队列（362例，包括330例疾病样本和32例对照）
重点核对
样本分组：来自5例转移性OSCC、5例原发性OSCC和5例癌旁组织的FFPE样本 差异表达阈值：p<0.05且|log2 fold change|>1 生物标志物筛选：CytoHubba五种算法取交集，单变量Cox回归和K-M分析验证 qRT-PCR验证：使用β-actin作为内参，2^-ΔΔCt法计算相对表达量 免疫组化验证：抗体稀释度（ANPEP 1:100, APOB 1:200, GLP1R 1:200）和抗原修复条件
摘要
背景：口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，具有高耐药性和不良治疗结果的特点。这强调了识别OSCC新生物标志物的迫切需求。方法：使用全转录组测序数据，鉴定原发组与对照组、转移组与原发组之间的差异表达信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）（DE-mRNA、DE-miRNA和DE-lncRNA）。候选OSCC基因来源于DE-mRNA。随后使用CytoHubba的五个算法鉴定潜在生物标志物。通过单变量Cox回归和Kaplan-Meier（K-M）生存分析验证生物标志物。其他分析包括亚细胞定位、突变分析和基因集富集分析（GSEA）。还确定了OSCC治疗的关键药物。采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫组织化学验证关键生物标志物的表达水平。结果：共鉴定出304个候选基因，五个算法选出29个潜在生物标志物。ANPEP、APOB、GLP1R和SI在K-M曲线中表现出显著的生存差异，将其确立为OSCC生物标志物。这些生物标志物主要定位于细胞质，其中SI和APOB显示出最高的突变易感性。富集分析显示'干扰素-γ应答'生物学功能由ANPEP、APOB和SI共同富集。此外，BIBW2992（阿法替尼）和PF.02341066（克唑替尼）与生物标志物的相关性最强，提示其可能作为OSCC治疗的关键药物。此外，研究结果通过qRT-PCR和免疫组化分析得到验证，结果与RNA-seq数据一致。结论：ANPEP、APOB、GLP1R和SI被确定为潜在的OSCC生物标志物，为进一步研究和治疗开发提供了有价值的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 旨在通过全转录组测序和生物信息学分析识别与OSCC转移相关的潜在生物标志物。
- 核心机制
- ANPEP、APOB和SI共同富集干扰素-γ应答通路；APOB、GLP1R与趋化因子CCL11显著正相关，SI与CXCL6和CXCL8正相关。
- 主要证据
- 基于全转录组测序筛选出304个候选基因，通过CytoHubba五种算法鉴定出29个潜在生物标志物，其中ANPEP、APOB、GLP1R和SI在K-M曲线中显示出显著生存差异，并通过qRT-PCR和免疫组化验证。
- 研究意义
- ANPEP、APOB、GLP1R和SI可作为OSCC的潜在生物标志物，可能用于早期检测和预后评估，并为靶向治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异表达分析
鉴定原发组与对照组、转移组与原发组之间的差异表达mRNA、miRNA和lncRNA。
使用DESeq2（p<0.05，|log2FC|>1）筛选DE-mRNA、DE-miRNA和DE-lncRNA，并取转移特异部分作为候选基因。
生信分析
通过多种生信方法筛选并验证潜在的生物标志物及其相关功能和网络。
构建PPI网络和ceRNA网络，使用CytoHubba五种算法筛选潜在生物标志物，进行单变量Cox回归和K-M生存分析，并进行亚细胞定位、突变分析、GSEA、药物敏感性和免疫特征分析。
实验验证
通过qRT-PCR和免疫组化验证关键生物标志物的表达水平与RNA-seq结果的一致性。
从患者组织提取RNA进行qRT-PCR（SYBR Premix Ex TaqII），并使用IHC染色评估ANPEP、APOB和GLP1R的蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol | Takara | -- |
| TRIzol总RNA提取试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 文库构建 | Small RNA样品前处理试剂盒 | -- | -- |
| Epicentre Ribo-zero rRNA去除试剂盒 | Epicentre | -- | |
| NEBNext Ultra定向RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| RNA质量检测 | NanoDrop分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| Qubit 2.0荧光计 | Life Technologies | -- | |
| Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 测序 | Illumina Novaseq 6000 | Illumina | -- |
| qRT-PCR | PrimeScript RT试剂盒（带gDNA Eraser） | Takara | -- |
| SYBR Premix Ex TaqII | Takara | -- | |
| ABI 7500系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫组化 | ANPEP兔多克隆抗体 | -- | APR25992N |
| APOB抗体 | Fine Test | FNab00491 | |
| GLP1R兔多克隆抗体 | Bioss | bs-1559R | |
| 二抗 | Proteintech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本来源：5例转移性OSCC、5例原发性OSCC和5例癌旁组织；对照样本距肿瘤边缘至少1cm；FFPE处理。 阅读提示：见Materials and methods部分“Associated data” |
| 全转录组测序 | RNA提取使用TRIzol；文库构建方法；测序平台（Illumina Novaseq 6000）和读长（SE50和PE150）。 阅读提示：见Materials and methods部分“Whole transcriptome sequencing” |
| 差异表达分析 | 差异表达阈值：p<0.05，|log2 fold change|>1；DESeq2版本。 阅读提示：见Materials and methods部分“Identification of differentially expressed mRNAs...” |
| 生物标志物筛选 | CytoHubba算法（Degree, MCC, Closeness, Radiality, Stress）取前50；单变量Cox回归p<0.05；K-M分析分组依据。 阅读提示：见Materials and methods部分“Identification of biomarkers”和“Results”部分 |
| 验证实验 | qRT-PCR引物序列；内参β-actin；IHC一抗稀释度和抗原修复条件。 阅读提示：见Materials and methods部分“qRT-PCR和Immunohistochemistry validation” |