构建LARS过表达和敲低稳定细胞系
研究LARS在MAC-T细胞中的功能
利用慢病毒包装技术，在HEK293T细胞中包装LARS过表达和敲低病毒，感染MAC-T细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。
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亮氨酰-tRNA合成酶通过mTORC1-LAT1通路调控奶牛酪蛋白合成
Leucyl-tRNA synthetase regulates casein synthesis in dairy cows via the mTORC1-LAT1 pathway.
实验完整度
高包含体外细胞模型（MAC-T、HEK293T），过表达和敲低稳定细胞系验证，以及CCK-8、EdU、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等多项功能验证和机制验证。
主要模型
牛乳腺上皮细胞MAC-T HEK293T细胞（用于病毒包装）
重点核对
LARS过表达和敲低稳定细胞系的构建及验证 亮氨酸饥饿和刺激条件（饥饿4小时，刺激0.9 mM亮氨酸1小时） 雷帕霉素（mTORC1抑制剂）处理浓度和时间 BCH（LAT1抑制剂）处理浓度和时间 BC-LI-0186（LARS亮氨酸感知抑制剂）处理条件
摘要
目的：亮氨酰-tRNA合成酶（LARS）是哺乳动物中必需的多功能酶，在维持细胞蛋白质和氨基酸平衡中起关键作用。它促进tRNA氨酰化，启动细胞内蛋白质合成，并作为细胞内亮氨酸传感器。传感器功能使LARS能够通过Rag GTPase结合激活mTORC1通路，在蛋白质合成调控中发挥关键作用。尽管其重要性，这些功能的确切机制尚未完全阐明。本研究探讨LARS及其在调节乳蛋白合成中的作用。方法：本研究利用稳定的牛乳腺上皮细胞系、LARS过表达和LARS敲低，并通过Cell Counting Kit-8、Click-iT EdU、Western blot、实时荧光定量聚合酶链反应和免疫共聚焦技术进行验证。结果：我们的研究结果表明，牛乳腺上皮细胞（MAC-T）中LARS过表达增强细胞增殖并提高细胞内亮氨酸水平，从而通过mTORC1通路增加酪蛋白产生。LARS通过机械性靶标雷帕霉素复合物1、L型氨基酸转运体1（mTORC1-LAT1）通路增强酪蛋白表达。这种相互作用得到LAT1的正反馈机制支持，增强mTORC1通路的激活。此外，LARS过表达导致LAT1表达增加、LAT1稳定性提高以及其膜定位增强。我们的研究表明，LARS对LAT1表达的增强依赖于其在翻译和亮氨酸感知中的双重作用，而其影响LAT1定位则完全依赖于其亮氨酸感知功能。结论：LARS通过检测细胞内亮氨酸水平，经mTORC1通路调节LAT1表达和膜定位，从而影响酪蛋白合成。这些见解为提高乳蛋白产量奠定了理论基础，并为改善乳制品质量提供了新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LARS是否通过mTORC1-LAT1通路调控奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成？
- 核心机制
- LARS作为细胞内亮氨酸传感器，通过mTORC1通路调节LAT1表达和膜定位，LAT1再通过正反馈激活mTORC1，最终促进酪蛋白合成。
- 主要证据
- 在MAC-T细胞中，LARS过表达增强酪蛋白表达和S6K磷酸化，敲低则降低；雷帕霉素抑制mTORC1后减弱LARS效应；BCH抑制LAT1后减弱LARS效应；BC-LI-0186抑制LARS传感器功能后影响LAT1表达和定位。
- 研究意义
- 揭示LARS调控乳蛋白合成的新机制，为提高乳蛋白产量和改善乳制品质量提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测LARS对MAC-T细胞增殖的影响
探究LARS是否影响细胞增殖
使用CCK-8和EdU实验分别检测细胞活力和增殖。
检测LARS对酪蛋白表达的影响
探究LARS是否调控酪蛋白合成
使用qRT-PCR和Western blot检测α-酪蛋白和β-酪蛋白的mRNA和蛋白水平。
验证LARS通过mTORC1通路调控酪蛋白合成
确定mTORC1通路是否介导LARS的作用
在亮氨酸充足或饥饿条件下，用雷帕霉素抑制mTORC1，检测酪蛋白表达和S6K磷酸化。
验证LARS通过mTORC1-LAT1通路调控酪蛋白合成
确定LAT1在LARS调控酪蛋白中的作用
使用LAT1抑制剂BCH处理，检测酪蛋白表达和S6K磷酸化。
探究LARS对LAT1表达和稳定性的影响
确定LARS如何调节LAT1表达
通过qRT-PCR和Western blot检测LAT1 mRNA和蛋白水平，使用放线菌酮处理检测LAT1蛋白降解速率。
探究LARS对LAT1膜定位的影响
确定LARS是否调节LAT1亚细胞分布
通过Western blot检测膜组分中LAT1水平，并使用免疫荧光共聚焦检测LAT1定位。
区分LARS的翻译功能和亮氨酸感知功能
确定LARS调控LAT1的机制依赖其哪种功能
使用BC-LI-0186抑制LARS的亮氨酸感知功能，检测LAT1表达和定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 催乳素 | -- | -- | |
| 聚乙烯亚胺转染试剂 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| EdU试剂 | -- | -- | |
| 荧光显微镜观察 | 荧光显微镜 | OLYMPUS U-RFL-T | -- |
| 酶标仪 | Infinite F50 Plus酶标仪 | TECAN | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 逆转录 | Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Akora Bio | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green Pro Taq HS预混qPCR试剂盒 | Eric Biotechnology | -- |
| ABI Step One Plus实时PCR仪 | ABI | -- | |
| Western blot | RIPA蛋白提取试剂 | -- | -- |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| LARS抗体 | Bioworld | BS72681 | |
| LAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 5347S | |
| 4F2hc抗体 | Proteintech | 15193-1-AP | |
| ATP1A1抗体 | Proteintech | 14418-1-AP | |
| mTOR抗体 | Proteintech | 66888-1-Ig | |
| S6K抗体 | Proteintech | 14485-1-AP | |
| p-S6K抗体 | Proteintech | 28735-1-AP | |
| α-酪蛋白抗体 | HUABIO | ER1905-45 | |
| β-酪蛋白抗体 | Bioss | bs-23551R | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | -- | -- | |
| 增强化学发光试剂 | -- | -- | |
| e-BLOT Touch成像仪 | e-BLOT | -- | |
| 免疫荧光 | coralite594标记二抗 | Proteintech | -- |
| DAPI溶液 | -- | -- | |
| 激光共聚焦显微镜 | Yohogawa CV1000 | -- | |
| 亮氨酸处理 | 亮氨酸 | -- | -- |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | -- | -- |
| BCH | -- | -- | |
| BC-LI-0186 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与诱导 | MAC-T细胞培养条件；泌乳诱导培养基成分（胰岛素、氢化可的松、催乳素浓度）；诱导时间 阅读提示：Methods: Cell lines and storage conditions; Cell culture and transfection |
| LARS过表达和敲低 | 慢病毒包装和感染效率；嘌呤霉素筛选浓度；LARS过表达和敲低效率验证 阅读提示：Methods: Construction of stable cell lines; Figure 1C-D |
| 细胞增殖检测 | CCK-8和EdU实验的具体条件和处理时间 阅读提示：Methods: Cell counting kit-8 assay; 5-Ethynyl 2′-deoxyuridine assay |
| 酪蛋白表达检测 | 诱导条件；qRT-PCR引物序列；Western blot抗体稀释比例 阅读提示：Methods: Quantitative real-time polymerase chain reaction; Western blot assay; Table 1 |
| 亮氨酸饥饿与刺激 | 亮氨酸饥饿时间和刺激时间；亮氨酸浓度 阅读提示：Methods: Leucine starvation and stimulation of cells; Figure 2D-E, Figure 5A-B |
| mTORC1抑制 | 雷帕霉素浓度和处理时间 阅读提示：Methods: 未明确，见图2F |
| LAT1抑制 | BCH浓度和处理时间 阅读提示：Methods: 未明确，见图3B |
| LARS亮氨酸感知功能抑制 | BC-LI-0186浓度和处理时间 阅读提示：Methods: 未明确，见图5C-D |