病毒繁殖和滴定
获得高滴度的TJ2016病毒用于动物接种。
在BHK-21细胞中连续传代TJ2016六次获得TJ2016-F6，通过微量感染性试验测定病毒滴度。
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中国基因II型阿卡斑病毒株（TJ2016）在小鼠模型中的致病性分析
Pathogenicity analysis of a Chinese Genogroup II Akabane virus strain (TJ2016) in mouse models.
实验完整度
高包含体外细胞培养与病毒滴定、体内小鼠模型（不同品系、年龄和途径）以及组织病理学和免疫组化验证，证据层级独立。
主要模型
7日龄昆明小鼠 8周龄昆明小鼠 7日龄Balb/c小鼠 8周龄Balb/c小鼠
重点核对
接种途径：脑内（IC）和腹腔（IP） 小鼠品系和年龄：昆明小鼠和Balb/c小鼠，7日龄和8周龄 接种剂量：10^4至10^6 TCID50/只 致死率和存活时间：IC途径75-100%死亡率，IP途径仅乳鼠致死 病毒组织嗜性：仅脑组织阳性，且神经元中检测到抗原
摘要
背景：阿卡斑病毒（AKAV）分为五个基因群（I至V），不同基因群的毒株表现出显著的致病性差异。我们于2016年在中国分离到一株基因II型AKAV毒株TJ2016，但其毒力尚不清楚。中国分离的其他基因II型毒株的致病潜力也未明确。本研究旨在确定TJ2016的致病性。方法：将7日龄或8周龄的昆明小鼠或Balb/c小鼠通过脑内（IC）、腹腔（IP）、皮下（SC）或肌肉（IM）途径接种TJ2016。监测并分析接种小鼠的临床症状、病理变化和AKAV分布。结果：无论小鼠品系或年龄如何，通过IC途径接种病毒导致接种小鼠75%~100%的死亡率。通过IP途径接种病毒杀死了75%至100%的乳鼠，但未杀死成年小鼠。所有通过SC和IM途径接种的小鼠均存活至试验结束。仅在死亡或在实验结束前被安乐死的小鼠的大脑中检测到AKAV。AKAV抗原仅在神经元细胞中可识别。仅在死亡或在实验结束前被安乐死的小鼠中观察到脑病变，如小胶质细胞增生和浸润、淋巴细胞和巨噬细胞血管周围套袖（PVC）、神经元变性/坏死、血管扩张和充血等。结论：我们通过不同途径接种乳鼠和成年小鼠，表征了TJ2016的毒力，并建立了实验性小鼠模型，这对疫苗/药物开发及病毒发病机制的进一步研究具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 中国基因II型AKAV毒株TJ2016的致病性如何，以及影响其致病性的因素。
- 核心机制
- TJ2016通过脑内途径对成年和乳鼠均具有致死性，通过腹腔途径仅对乳鼠致死；病毒主要感染神经元，导致脑部病理损伤，其致死毒力与脑内病毒复制效率相关。
- 主要证据
- 通过不同途径接种不同品系和年龄的小鼠，观察到死亡率和脑病变；RT-PCR和免疫组化检测显示病毒仅存在于脑组织并定位于神经元。
- 研究意义
- 建立了TJ2016小鼠感染模型，为疫苗/药物开发和病毒致病机制研究提供工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠接种
评估不同接种途径对不同品系和年龄小鼠的致病性。
对7日龄和8周龄的昆明小鼠和Balb/c小鼠，通过IC、IP、SC和IM途径接种TJ2016，观察存活率、临床症状和体重变化。
病毒分布检测
分析TJ2016在感染小鼠体内的组织嗜性。
收集脑、心、肝、脾、肺和肾，通过RT-PCR检测AKAV N基因。
病毒载量和感染性检测
定量脑组织中感染性病毒颗粒。
将脑组织匀浆，进行微量感染性试验和免疫荧光分析，计算病毒滴度。
组织病理学和免疫组化
评估脑部病理变化和病毒抗原分布。
对脑组织进行HE染色和IHC染色，评分镜下病变和抗原阳性细胞。
系统发育分析
确定TJ2016与其他AKAV毒株的遗传关系。
下载S和M段CDS序列，比对并构建最大似然法系统发育树。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 病毒检测 | RNA快速提取试剂盒 | TianGen Biotech | -- |
| RT-PCR | HiScript II一步法RT-PCR试剂盒 | Vazyme | -- |
| 免疫荧光 | FITC标记的山羊抗小鼠IgG | SolarbioLife Sciences | -- |
| HRP偶联的山羊抗小鼠IgG | SolarbioLife Sciences | -- | |
| EVOS FL细胞荧光成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 组织病理 | 山羊抗兔IgG H&L（HRP聚合物） | Bioss | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒制备 | BHK-21细胞培养条件、病毒传代次数、TCID50测定方法 阅读提示：Materials and methods, Cells, antibodies, and virus |
| 动物接种 | 小鼠品系、年龄、性别、接种途径、接种剂量、每组数量 阅读提示：Table 1, Table 3, Animal trials |
| 临床症状评估 | 临床评分系统（GCS和NSS）的详细标准、观察时间点 阅读提示：Table 2, Animal trials |
| 病毒分布检测 | RT-PCR引物序列、退火温度、循环数、阳性/阴性对照 阅读提示：RNA extraction and RT-PCR amplification |
| 病毒载量测定 | 脑组织匀浆方法、离心参数、微量感染性试验步骤、TCID50计算（Reed-Muench） 阅读提示：Virus titration and immunofluorescence assay (IFA) |
| 组织病理学和IHC | 固定液和固定时间、石蜡包埋、HE染色流程、IHC一抗稀释度、评分标准 阅读提示：Histopathology examination, Table 5 |