细胞培养与TINCR表达检测
比较TINCR在正常表皮细胞和皮肤癌细胞中的基础表达水平。
培养A431、A375和HACAT细胞，提取RNA，通过RT-qPCR检测TINCR表达。
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长链非编码RNA TINCR的过表达通过促进Myc和TERC基因的甲基化抑制皮肤鳞状细胞癌细胞
Overexpression of lncRNA TINCR inhibits cutaneous squamous cell carcinoma cells through promotes methylation of Myc and TERC genes.
实验完整度
中包含细胞系模型（A431、A375、HACAT）及过表达/敲低实验、CCK-8、Transwell、RT-qPCR、Western blot、MSP和RIP，但缺乏动物模型和患者样本等体内验证。
主要模型
A431皮肤鳞状细胞癌细胞系 A375黑色素瘤细胞系 HACAT正常表皮细胞系
重点核对
细胞系：A431（CSCC）、A375（黑色素瘤）和HACAT（正常表皮） TINCR过表达和敲低慢病毒载体（pLV-Puro-OE-TINCR和pLKO.1-shTINCR） CCK-8增殖实验：每孔2000个细胞，6个重复，24小时后检测OD450 Transwell迁移和侵袭实验：细胞密度2×10^5 cells/mL，上室100 μL，下室600 μL含10% FBS，培养24小时 MSP和RIP实验验证甲基化和DNMT1结合
摘要
长链非编码RNA（lncRNA）TINCR已被证明在多种肿瘤中发挥关键的调控作用。然而，其在皮肤鳞状细胞癌（CSCC）中的具体作用机制仍不清楚。本研究旨在探讨lncRNA TINCR在CSCC中的作用。我们利用过表达技术研究TINCR对CSCC细胞的影响。采用甲基化特异性PCR（MSP）和RNA免疫沉淀（RIP）实验评估TINCR对Myc和TERC基因启动子区域甲基化的影响，及其与DNA甲基转移酶1（DNMT1）的相互作用。结果表明，TINCR的过表达显著促进了Myc（N-MYC、L-MYC和c-MYC）和TERC基因启动子区域的甲基化，抑制了CSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。MSP和RIP实验进一步证实，TINCR与DNMT1结合，增强了Myc和TERC基因启动子区域的甲基化水平。这些发现提示，lncRNA TINCR可能通过调控关键致癌基因的甲基化，成为CSCC的潜在治疗靶点。这些发现为CSCC的分子机制提供了新的见解，并强调了靶向TINCR的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨lncRNA TINCR在皮肤鳞状细胞癌（CSCC）中的作用及其具体分子机制，特别是其通过调控Myc和TERC基因甲基化影响肿瘤细胞行为。
- 核心机制
- lncRNA TINCR通过与DNMT1结合，促进Myc（N-MYC、L-MYC、c-MYC）和TERC基因启动子区域的甲基化，抑制这些基因的表达，从而抑制CSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。
- 主要证据
- 在A431细胞中过表达TINCR后，MSP显示Myc和TERC启动子甲基化水平显著升高（甲基化率100%），RIP显示TINCR与DNMT1结合增强；同时RT-qPCR和Western blot显示N-MYC、L-MYC、c-MYC和TERC表达下调，CCK-8和Transwell实验显示细胞增殖、迁移和侵袭能力降低。
- 研究意义
- 揭示了TINCR作为表观遗传调控因子在CSCC中的肿瘤抑制作用，为CSCC的治疗提供了新的潜在靶点，并为开发靶向TINCR的治疗策略提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TINCR过表达和敲低
建立TINCR过表达和敲低的A431稳定细胞系，以评估TINCR功能。
构建慢病毒载体pLV-Puro-OE-TINCR和pLKO.1-shTINCR，感染A431细胞，用嘌呤霉素筛选，RT-qPCR验证表达。
细胞增殖检测
检测TINCR过表达和敲低对A431细胞增殖能力的影响。
使用CCK-8试剂盒，在96孔板中培养细胞，24小时后加入CCK-8溶液，测定OD450。
细胞迁移和侵袭检测
检测TINCR过表达和敲低对A431细胞迁移和侵袭能力的影响。
使用Transwell小室，铺Matrigel，上室加入细胞悬液，下室加入含10% FBS的培养基，培养24小时后固定染色并计数。
Myc和TERC表达检测
检测TINCR对Myc基因家族和TERC mRNA及蛋白表达的影响。
使用RT-qPCR检测mRNA表达，Western blot检测蛋白表达。
启动子甲基化检测
检测TINCR过表达和敲低对Myc和TERC基因启动子甲基化水平的影响。
使用甲基化特异性PCR（MSP）评估N-MYC、L-MYC、c-MYC和TERC启动子甲基化状态。
TINCR与DNMT1结合检测
验证TINCR与DNMT1的相互作用。
使用RNA免疫沉淀（RIP）实验，用DNMT1抗体沉淀RNA，RT-qPCR检测TINCR富集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| P3000试剂 | -- | -- | |
| Opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| 慢病毒包装 | ViraPower慢病毒包装系统 | Invitrogen | -- |
| 细胞转染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| RNA提取 | FastPure gDNA过滤柱III | -- | -- |
| Buffer RL | -- | -- | |
| Buffer RW1 | -- | -- | |
| Buffer RW2 | -- | -- | |
| Nano 600分光光度计 | -- | -- | |
| 逆转录 | Hiscript III RT SuperMix qPCR试剂盒 | -- | -- |
| RT-qPCR | SYBR qPCR预混液 | -- | -- |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| CCK-8实验 | CCK-8溶液 | -- | -- |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| N-Myc抗体#9405 | Cell Signaling Technology | 9405 | |
| L-Myc (E3M5P)兔单克隆抗体#76266 | Cell Signaling Technology | 76266 | |
| c-Myc抗体#9402 | Cell Signaling Technology | 9402 | |
| β-肌动蛋白抗体#4967 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| 山羊抗兔IgG H&L/HRP | Bioss | -- | |
| MSP | M-稀释缓冲液 | -- | -- |
| CT转化试剂 | -- | -- | |
| M-洗脱缓冲液 | -- | -- | |
| 2× KeyPo预混液 | -- | -- | |
| 琼脂糖 | -- | -- | |
| 溴化乙锭 | -- | -- | |
| RIP | Buffer A | -- | -- |
| Buffer D | -- | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| RNA酶抑制剂 | -- | -- | |
| 磁力架 | -- | -- | |
| RC离心柱 | -- | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源：A431、A375、HACAT购买自厦门伊莫生物技术有限公司；培养基：DMEM含10%FBS和1%青霉素/链霉素；培养条件：37℃、5% CO2 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| 慢病毒转染 | 载体构建：pLV-Puro-OE-TINCR和pLKO.1-shTINCR由吉玛基因合成；转染试剂：Lipofectamine 3000；感染条件：polybrene终浓度8 μg/mL，感染8小时；筛选：嘌呤霉素1 μg/mL，7天 阅读提示：Materials and methods, Lentiviral vector construction and packaging, Cell transfection, Knockdown experiment |
| RT-qPCR | RNA提取：Buffer RL, gDNA过滤柱；逆转录：Hiscript III RT SuperMix，500ng RNA；PCR程序：95℃ 30s，40个循环95℃ 10s、60℃ 30s；内参：GAPDH 阅读提示：Materials and methods, RT-qPCR analysis, Table 1 |
| CCK-8 | 细胞接种密度：2000 cells/well；重复数：6个重复；检测时间：24小时后加CCK-8 10 μL，2小时后测OD450 阅读提示：Materials and methods, CCK-8 cell proliferation assay |
| Transwell | Matrigel稀释比例1:4，包被50 μL；细胞密度2×10^5 cells/mL，上室100 μL，下室600 μL含10% FBS；培养24小时；固定和染色：4%多聚甲醛20分钟，0.5%结晶紫10分钟 阅读提示：Materials and methods, Transwell invasion and migration assay |
| Western blot | 细胞密度1×10^6 cells/well；裂解：RIPA+PMSF；抗体：N-Myc #9405, L-Myc #76266, c-Myc #9402, β-Actin #4967 (CST, 1:1000), Goat Anti-Rabbit IgG HRP (Bioss, 1:20000) 阅读提示：Materials and methods, Western blot analysis |
| MSP | DNA修饰：M-Dilution Buffer 42℃ 30min，CT Conversion Reagent 80℃ 60min；PCR：2×KeyPo Master Mix，95℃ 5min，36个循环95℃ 10s、60℃ 35s；凝胶电泳：2%琼脂糖，EB染色 阅读提示：Materials and methods, Methylation-specific PCR, Table 2 |
| RIP | 细胞量1×10^7；Buffer A含蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂；抗体：DNMT1；IgG对照；磁力架收集；RT-qPCR检测TINCR 阅读提示：Materials and methods, RNA immunoprecipitation assay, Table 3 |