观察JOSD2在高血压血管组织中的表达
检测JOSD2在高血压患者及Ang II处理小鼠血管组织中的表达水平及细胞定位。
收集高血压患者和正常人的血管组织，以及Ang II或生理盐水灌注的小鼠主动脉，通过Western blot、RT-qPCR和免疫荧光检测JOSD2的表达和定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
JOSD2通过去泛素化并稳定SMAD7抑制血管紧张素II诱导的血管重塑
JOSD2 inhibits angiotensin II-induced vascular remodeling by deubiquitinating and stabilizing SMAD7.
实验完整度
高包含体内基因敲除和AAV9介导的VSMC特异性过表达小鼠模型、体外原代VSMC和细胞系功能实验，并结合RNA-seq、LC-MS/MS及泛素化机制验证，多层级证据链完整。
主要模型
C57BL/6小鼠（JOSD2全身敲除及VSMC特异性过表达模型） 小鼠原代主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs） MOVAS小鼠血管平滑肌细胞系 HEK-293T人胚肾细胞系
重点核对
Ang II给药剂量：1000 ng·kg^-1·min^-1，皮下渗透泵持续4周 AAV9-SM22α-JOSD2注射剂量：3×10^11 viral particles/只，尾静脉注射 体外Ang II刺激浓度：1 μM，处理24小时 CHX处理浓度：50 μg/ml，用于检测SMAD7蛋白稳定性 MG132处理浓度：10 μM，处理6小时，用于检测泛素化水平
摘要
血管紧张素II（Ang II）水平升高在高血压性血管重塑的发展中起核心作用。在本研究中，我们鉴定出去泛素化酶Josephin结构域蛋白2（JOSD2）是一个保护因子，并研究了其在Ang II诱导的血管重塑中的分子机制。首先，我们发现JOSD2在Ang II攻击的小鼠血管组织的主动脉平滑肌细胞中上调，但在内皮细胞中没有。全身性敲除JOSD2显著加重了小鼠中Ang II诱导的血管重塑。相反，血管平滑肌细胞（VSMC）特异性过表达JOSD2逆转了Ang II诱导的血管重塑。在体外，JOSD2缺乏加剧了Ang II诱导的VSMC纤维化、增殖和迁移，而这些变化被JOSD2过表达所逆转。RNA-seq分析显示JOSD2在VSMCs中的保护作用与TGFβ-SMAD通路有关。此外，LC-MS/MS分析鉴定出SMAD7（TGFβ-SMAD通路的负调控因子）为JOSD2的底物。JOSD2特异性结合SMAD7的MH1结构域，去除SMAD7第220位赖氨酸上的K48连接泛素链，以维持SMAD7的稳定性。总之，我们的发现揭示了JOSD2-SMAD7轴对于缓解Ang II诱导的血管重塑至关重要，且JOSD2可能成为高血压性血管重塑的新型潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- JOSD2在Ang II诱导的血管重塑中扮演何种角色及其分子机制是什么？
- 核心机制
- JOSD2通过其活性位点C24结合SMAD7的MH1结构域，去除SMAD7第220位赖氨酸（K220）上的K48连接多聚泛素链，从而稳定SMAD7蛋白，抑制TGFβ-SMAD3通路激活。
- 主要证据
- 体内实验显示JOSD2敲除加重Ang II诱导的血管重塑，VSMC特异性过表达逆转重塑；体外实验显示JOSD2抑制VSMC纤维化、增殖和迁移；RNA-seq、LC-MS/MS、Co-IP和泛素化实验证实JOSD2-SMAD7相互作用及K220去泛素化。
- 研究意义
- 该研究首次揭示JOSD2直接切割SMAD7 K220位点的K48连接泛素链以稳定SMAD7蛋白，持续抑制VSMCs中的TGFβ-SMAD3信号，表明JOSD2可能成为治疗血管重塑相关疾病的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估全身性JOSD2敲除对体内血管重塑的影响
明确JOSD2缺失是否加重Ang II诱导的血管重塑。
对WT和JOSD2敲除小鼠进行Ang II或生理盐水灌注，通过组织学染色和Western blot分析血管形态、胶原沉积和蛋白表达。
验证VSMC特异性JOSD2过表达对体内血管重塑的作用
检验VSMC中JOSD2过表达是否能逆转Ang II诱导的血管重塑。
通过尾静脉注射AAV9-SM22α-JOSD2或对照病毒，再Ang II灌注，通过组织学和分子生物学检测血管重塑相关指标。
体外研究JOSD2对VSMC纤维化、增殖和迁移的影响
确定JOSD2是否在细胞水平调控Ang II诱导的VSMC功能变化。
分离原代VSMCs，使用siRNA或质粒敲低或过表达JOSD2，用Ang II处理，然后检测纤维化标志物、增殖和迁移能力。
鉴定JOSD2的底物及结合区域
寻找JOSD2在VSMCs中的底物蛋白，并确定其相互作用的结构域。
通过LC-MS/MS鉴定JOSD2互作蛋白，并通过Co-IP验证JOSD2与SMAD7的结合，使用SMAD7截短突变体确定结合区域。
验证JOSD2对SMAD7稳定性和泛素化的影响
证明JOSD2通过去泛素化增强SMAD7的蛋白稳定性。
在JOSD2敲除或过表达细胞中检测SMAD7蛋白水平和半衰期，并分析SMAD7的泛素化和K48连接链。
确定JOSD2去泛素化SMAD7的特异性位点
确定JOSD2去除SMAD7上哪个赖氨酸残基的泛素链。
通过预测和突变实验，构建SMAD7的K64R、K220R、K373R突变体，检测JOSD2对其泛素化水平的影响。
验证JOSD2-SMAD7轴对TGFβ-SMAD通路及VSMC表型的影响
确认JOSD2通过SMAD7影响TGFβ-SMAD3通路的激活及VSMC功能。
在JOSD2过表达或敲低细胞中检测SMAD3与TGFBR1的相互作用、SMAD3磷酸化及核转位，并使用SMAD7敲低或K220R突变体回补实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 血管紧张素II | Sigma-Aldrich; MedChemExpress | A9525; HY-13948 |
| 免疫印迹 | GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 |
| 磷酸化SMAD3抗体 | Cell Signaling Technology | 9520 | |
| SMAD3抗体 | Cell Signaling Technology | 9523 | |
| 免疫荧光 | α-SMA抗体 | Abcam | ab7817 |
| CD31抗体 | Abcam | ab9498 | |
| 免疫印迹 | Cyclin D1抗体 | Abcam | ab226977 |
| Lamin B1抗体 | Abcam | ab133741 | |
| 胶原蛋白III抗体 | HUABIO | HA720050 | |
| 骨桥蛋白抗体 | Proteintech | 22952-1-AP | |
| 胶原蛋白I抗体 | Proteintech | 66761-1-Ig | |
| Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| GFP抗体 | Proteintech | 66002-1-Ig | |
| His抗体 | Proteintech | 10001-0-AP | |
| SMAD7抗体 | ABclonal | A12343 | |
| PCNA抗体 | ABclonal | A12427 | |
| TGFBR1抗体 | ABclonal | A22151 | |
| JOSD2抗体 | Biorbyt | orb184482 | |
| JOSD2抗体 | Bioss | bs-17207R | |
| SMAD7抗体 | Bioss | bs-33869m | |
| 动物实验 | 渗透泵 | Alzet | 1004 MODEL |
| 血压测量 | 尾套遥测血压系统 | Softron Biotechnology | BP-2010A |
| 组织学染色 | Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 |
| 天狼星红染色试剂盒 | Solarbio | S8060 | |
| 地衣红染色试剂盒 | Solarbio | G1589 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | BioChannel | BC-SE-FBS07 |
| DMEM培养基 | Gibco | C11885500BT | |
| MOVAS细胞 | iCell | iCell-m088 | |
| 人脐静脉内皮细胞 | iCell | iCell-h110 | |
| HEK-293T细胞 | iCell | iCell-h237 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 细胞增殖检测 | BeyoClick EdU细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | C0075S |
| 迁移实验 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 染色 | 结晶紫 | Beyotime | C0121 |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | Takara | 9109 |
| 逆转录 | HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | R323-01 |
| qPCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 |
| QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 蛋白提取 | 裂解缓冲液 | Boster Biological Technology | AR0103 |
| Western blot | PVDF膜 | Bio-Rad | 1620177 |
| 增强型化学发光试剂 | Bio-Rad | 1705060 | |
| 免疫共沉淀 | IP裂解液 | Beyotime | P0013 |
| Protein A+G琼脂糖 | Beyotime | P2012 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 小鼠品系、年龄、性别、JOSD2敲除和过表达方式、Ang II给药剂量和方式、渗透泵型号、血压测量方法 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |
| 细胞实验 | 细胞类型、培养基、Ang II浓度和处理时间、siRNA和质粒转染方法、转染试剂 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection |
| 组织学分析 | 切片厚度、染色试剂盒品牌和货号、显微镜参数 阅读提示：Materials and methods: Histological analysis |
| 蛋白检测 | 抗体品牌和货号、蛋白上样量、封闭液、二抗稀释比例、曝光时间 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |
| 泛素化实验 | 质粒构建、MG132浓度和处理时间、CHX浓度和时间点、IP抗体、泛素化检测方法 阅读提示：Materials and methods: Co-immunoprecipitation; Results: JOSD2 deubiquitinates SMAD7 at K220 residue |
| 转录组测序 | RNA提取方法、文库构建平台、差异表达基因筛选阈值（fold change >2或<0.5, P<0.05）、富集分析数据库 阅读提示：Materials and methods: Transcriptome sequencing |