hiPSCs培养与鉴定
验证hiPSCs的多能性和自我更新特性
使用无饲养层方法培养hiPSCs，通过免疫荧光检测OCT4、SOX2、NANOG的表达
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
miR-122-5p通过诱导hiPSCs分化为肝细胞样细胞抑制肝癌细胞的上皮间质转化
MiR-122-5p inhibits the epithelial mesenchymal transition of liver cancer cells by inducing hiPSCs to differentiate into hepatocyte-like cells.
实验完整度
中包含细胞培养、免疫荧光、流式、RT-PCR、Western blot、CCK8、Transwell、划痕、凋亡检测等体外实验，但缺乏动物模型和临床样本验证。
主要模型
hiPSCs细胞系 HepG2肝癌细胞系
重点核对
hiPSCs来源：Ubigene Biotechnology Co., Ltd. HepG2细胞来源：Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 共培养体系中，hiPSCs接种于Transwell上层（1×10^6细胞/孔），HepG2细胞接种于6孔板下层（1×10^6细胞/孔） 转染剂量：5 μL mimic/inhibitor, 120 μL riboFECT CP Buffer, 12 μL riboFECT CP Reagent，共孵育48小时 EMT标志物检测：E-Cadherin和N-Cadherin的mRNA和蛋白表达水平
摘要
上皮间质转化（EMT）与肝癌预后、侵袭性和攻击性密切相关。一种有前景的肝癌治疗方法是细胞治疗，即刺激干细胞发育为功能性肝细胞。本研究旨在探讨miR-122-5p对人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为肝细胞样细胞的影响，及其对肝癌细胞EMT过程的作用。在hiPSCs中过表达或沉默miR-122-5p，分析肝特异性标志物（包括AFP、ALB和ASGPR）的表达，以确认肝细胞样分化。同时使用与HepG2肝癌细胞的共培养体系，评估过表达miR-122-5p的hiPSCs或沉默miR-122-5p的hiPSCs对EMT标志物表达的影响。结果显示，hiPSCs中miR-122-5p的过表达诱导了肝细胞样特性，表现为AFP、ALB和ASGPR水平升高。然而，敲低miR-122-5p则产生相反效果。在共培养体系中，过表达miR-122-5p的hiPSCs抑制了HepG2细胞的EMT过程，导致间充质标志物水平升高和上皮标志物水平降低。总之，miR-122-5p促进hiPSCs分化为肝细胞样细胞，并抑制肝癌细胞的EMT过程。靶向miR-122-5p可能通过细胞治疗预防肝癌进展的新方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-122-5p是否通过诱导hiPSCs分化为肝细胞样细胞来抑制肝癌细胞的上皮间质转化过程？
- 核心机制
- miR-122-5p通过促进hiPSCs向肝细胞样细胞分化，进而抑制HepG2细胞的上皮间质转化，表现为E-Cadherin上调、N-Cadherin下调
- 主要证据
- 实验中，在hiPSCs中过表达miR-122-5p后，肝脏标志物（AFP, ALB, ASGPR）表达增加，而敲低则降低；与HepG2共培养时，过表达miR-122-5p的hiPSCs增加了上皮标志物E-Cadherin表达，降低了间充质标志物N-Cadherin表达，同时抑制了HepG2细胞的增殖、迁移、侵袭，并诱导凋亡
- 研究意义
- miR-122-5p处理的hiPSCs可能作为治疗终末期肝衰竭的新型细胞来源，为肝癌的靶向诊断和治疗提供了重要的理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
miR-122-5p过表达或敲低及hiPSCs分化检测
探究miR-122-5p对hiPSCs增殖和肝细胞样分化的影响
用miR-122-5p mimic或inhibitor转染hiPSCs，通过CCK8、流式、免疫荧光和RT-PCR检测增殖和肝细胞标志物表达
与HepG2共培养及恶性表型分析
评估miR-122-5p修饰的hiPSCs对肝癌细胞恶性表型的影响
将hiPSCs和HepG2细胞共培养，通过CCK8、Transwell、划痕和流式凋亡检测评估HepG2细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡
EMT标志物检测
验证miR-122-5p修饰的hiPSCs对HepG2细胞EMT的影响
通过RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测E-Cadherin和N-Cadherin表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EZ stemTM干细胞完全培养基 | Ubigene Biotechnology | -- |
| EZ干细胞消化液 | Ubigene Biotechnology | -- | |
| MEM（含NEAA）培养基 | Pricella | -- | |
| 胎牛血清 | Excell Bio | -- | |
| 链霉素 | Beyotime | -- | |
| 青霉素 | Beyotime | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X100 | Beyotime | -- |
| 山羊血清 | Bioss | -- | |
| OCT4抗体 | Abcam | ab181557 | |
| SOX2抗体 | Abcam | ab92494 | |
| NANOG抗体 | Abcam | ab109250 | |
| ALB抗体 | Abcam | ab19194 | |
| ASGPR抗体 | Abcam | ab254262 | |
| E-cadherin抗体 | Abcam | ab1416 | |
| N-cadherin抗体 | Abcam | ab18203 | |
| Alexa Fluor® 488标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor® 594标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab150080 | |
| DAPI | -- | -- | |
| EVOS M5000荧光显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| 转染 | riboFECT CP缓冲液 | Ribobio | -- |
| riboFECT CP试剂 | Ribobio | -- | |
| CCK8检测 | CCK8试剂盒 | Bioss | -- |
| RT-6000酶标仪 | Rayto | -- | |
| 流式细胞术 | ASGPR抗体 | Abcam | ab254262 |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Abcam | ab6717 | |
| 流式细胞仪（BD FACSCanto II） | BD Biosciences | -- | |
| RT-PCR | 细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | Vazyme | -- |
| Nano 600 | Jiapeng | -- | |
| HiScript lll 第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Taq Pro Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | NCM Biotech | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 抗E-Cadherin抗体 | Abcam | ab40772 | |
| 抗N-Cadherin抗体 | Abcam | ab18203 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 山羊抗兔IgG H&L/HRP二抗 | Bioss | bs-0295G-HRP | |
| 化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| Transwell检测 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 结晶紫染色液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 凋亡检测 | AnnexinV-FITC试剂盒 | Beyotime | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | hiPSCs和HepG2细胞的来源、培养基组成（如FBS浓度、抗生素浓度）、培养条件（温度、CO2浓度）、传代比例和消化时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture |
| 转染 | 转染试剂（riboFECT CP Buffer和Reagent）用量、miR-122-5p mimic/inhibitor及对照的浓度和孵育时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: Cell transfection |
| 共培养 | 共培养体系中hiPSCs和HepG2细胞的接种密度、Transwell规格、上层和下层培养基类型 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture |
| EMT检测 | E-Cadherin和N-Cadherin的抗体稀释比例、RT-PCR引物序列、Western blot上样量（20 μg） 阅读提示：Materials and Methods: RT-PCR, Western blot |
| 功能检测 | CCK8检测时的细胞密度和处理时间、Transwell实验的细胞浓度（1-5×10^5 cells/mL）、划痕实验的细胞密度（1×10^6/well）和观察时间（24小时）、凋亡检测的试剂盒和染色步骤 阅读提示：Materials and Methods: CCK8, Transwell, Wound healing, Detection of cell apoptosis |