细菌菌株和培养
制备野生型和突变体菌株用于体内感染实验
使用野生型SL1344及ΔsirA、ΔcsrB/C和ΔhilD突变体，在LB培养基中37°C过夜培养，然后转接培养5-6小时，必要时使用链霉素或卡那霉素筛选
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当鼠伤寒沙门氏菌在肠腔中时，SirA、CsrBC和HilD形成体内调控级联反应，控制SPI-1和SPI-2基因的表达，并且在禽类模型中为盲肠定植和肝脏播散所必需
SirA, CsrBC and HilD form in vivo a regulatory cascade that controls the SP1-1 and SPI-2 gene expression when Salmonella Typhimurium is in the intestinal lumen and are required for cecal colonization and liver dissemination in the avian model.
实验完整度
高包含体内感染模型（1日龄和1周龄鸡）、CFU计数、组织病理学、免疫组化、qRT-PCR基因表达分析等多个独立实验层级，并进行功能验证（突变体表型）和机制验证（级联调控）。
主要模型
1日龄SPF鸡 1周龄SPF鸡 鼠伤寒沙门氏菌SL1344野生型及突变体
重点核对
鸡的日龄（1日龄vs 1周龄） 感染剂量：10^10 CFU 采样时间点：1日龄鸡24、48、72 hpi；1周龄鸡1、3、7 dpi 基因表达分析时间点：接种后120分钟 盲肠和肝脏的CFU计数
摘要
当鼠伤寒沙门氏菌在体外LB中生长时，BarA/SirA系统诱导CsrB/C的表达，CsrB/C螯合调节因子CsrA，从而解除对HilD调节因子的抑制。激活的HilD诱导HilA和SsrB的表达，它们是SPI-1和SPI-2的中心调节因子。我们分析了这些基因在感染野生型鼠伤寒沙门氏菌菌株和ΔsirA、ΔcsrB/C和ΔhilD突变体的1日龄和1周龄鸡体内的贡献。肝脏和盲肠中的CFU测定显示，与野生型菌株相比，突变体在两个鸡模型中的两个器官定植量较低，并且它们在这些器官中产生组织学损伤的能力受到影响。我们通过分析接种野生型和突变体120分钟后鸡盲肠内容物中hilA、ssrAB、hilD、csrB和sirA的表达，分析了这些基因是否在体内且在肠道侵袭前以级联方式运作。ΔhilD菌株中hilA和ssrB的表达降低，但csrB和sirA的表达未降低。ΔcsrB/C样本中hilD、hilA和ssrB的表达降低，但sirA未降低。在SirA缺失时，所有基因的表达均降低。我们的研究结果表明，当沙门氏菌在肠腔中时，SirA、CsrB/C和HilD在体内构成一个调控级联，该级联在肠道侵袭前控制HilA和SsrB的表达。我们还证明这些基因是沙门氏菌感染鸡时产生病变所必需的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在鸡的肠道环境中，sirA、csrB/C和hilD是否在体内构成调控级联，并在肠道侵袭前控制SPI-1和SPI-2的表达，以及这些基因对肠道定植、系统播散和病变产生的作用
- 核心机制
- 在体内，SirA诱导csrB表达，csrB进而诱导hilD表达，hilD最终诱导hilA和ssrB表达，从而控制SPI-1和SPI-2的表达
- 主要证据
- 在1日龄和1周龄鸡中，与WT相比，ΔsirA、ΔcsrB/C和ΔhilD突变体在盲肠和肝脏中的CFU降低，组织病理学损伤减少，免疫组化定位减少；qRT-PCR分析显示在盲肠内容物中，ΔsirA中csrB、hilD、hilA和ssrB表达降低，ΔcsrB/C中hilD、hilA和ssrB降低但sirA不变，ΔhilD中仅hilA和ssrB降低
- 研究意义
- 该研究首次证明SirA、CsrB/C和HilD在鸡体内肠腔中构成调控级联，并揭示这些基因对于沙门氏菌在鸡中的盲肠定植、系统性播散和病变产生至关重要，可能解释了肠道腔内SPI-2基因表达的现象，并有助于理解沙门氏菌从细胞外到细胞内环境的成功转变机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鸡的感染
评估野生型和突变体在鸡体内的定植、播散和病变产生
对1日龄和1周龄SPF鸡口服接种10^10 CFU的细菌，在不同时间点处死，收集盲肠和肝脏样本
CFU计数
定量检测各菌株在盲肠和肝脏的定植量
将器官匀浆，进行十倍系列稀释，涂布于含有适当抗生素的LB和麦康凯琼脂平板，计数CFU
组织病理学分析
比较评估野生型和突变体引起的组织病变
盲肠和肝脏样品用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片，H&E染色，进行病理评分
免疫组化检测
在组织中定位野生型和突变体细菌，验证定植情况
使用多克隆抗鼠伤寒沙门氏菌一抗对组织切片进行免疫组化染色
基因表达分析
检测体内调控级联中基因的表达变化，验证级联关系
在接种后120分钟，提取盲肠内容物RNA，通过qRT-PCR检测sirA、csrB、hilD、hilA和ssrB的表达，以dnaK作为内参
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | LB肉汤 | -- | -- |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 卡那霉素 | -- | -- | |
| CFU计数 | 麦康凯琼脂 | -- | -- |
| 组织病理学 | 10%中性缓冲福尔马林 | -- | -- |
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini 试剂盒 | Qiagen | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Invitrogen | -- | |
| cDNA合成 | Revert Aid H Minus 第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| qRT-PCR | SensiFAST SYBR No-ROX 混合物 | Bioline | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养 | 菌株、培养基、培养温度、转速、抗生素浓度 阅读提示：Methods: Bacterial strains and growth conditions |
| 鸡感染 | 鸡的日龄、接种剂量、接种途径、采样时间点 阅读提示：Methods: Infection experiments |
| CFU计数 | 组织匀浆方法、稀释倍数、培养基、抗生素、培养时间 阅读提示：Methods: Determination of colony-forming-units (CFUs) |
| 组织病理学 | 固定、包埋、切片、染色、评分标准 阅读提示：Methods: Histopathological analysis |
| 免疫组化 | 抗体、抗原修复、显色方法 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry |
| 基因表达分析 | 样本采集时间、RNA提取方法、DNase处理、逆转录、qPCR条件、内参基因、数据分析方法、重复次数 阅读提示：Methods: Quantitative real-time RT-PCR (q-RT-PCR) assays |