细菌感染模型建立与内质网应激检测
确定espF缺失对EHEC感染诱导的ER应激的影响
使用Caco-2细胞感染野生型EHEC O157:H7 EDL933或espF缺失菌株，MOI为100，感染6小时，通过Western blot检测BiP、eIF2α、p-eIF2α、ATF4和CHOP蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肠出血性大肠杆菌O157:H7感染通过PERK通路抑制宿主肠上皮细胞的内质网应激
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Infection Inhibits Host Endoplasmic Reticulum Stress in Intestinal Epithelial Cells via the PERK Pathway.
实验完整度
中研究包含细菌感染模型、质粒转染、Western blot、免疫荧光、钙成像、凋亡检测等体外实验，有明确的功能验证和机制验证，但缺乏动物模型或患者样本等体内证据。
主要模型
Caco-2细胞感染模型 HeLa细胞转染模型
重点核对
模型：Caco-2细胞、HeLa细胞 感染条件：野生型EHEC O157:H7 EDL933 或 ΔespF 菌株，MOI=100，感染6小时 转染质粒：pEGFP (E)、pEGFP-EspF (EE)、pEYFP-EspF-T2A-ANXA6 (EYEA) 转染时长：48小时 检测指标：BiP、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平
摘要
肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7是一种食源性病原体，可引起多种疾病，从自限性胃肠炎到危及生命的肠外疾病，如溶血性尿毒症综合征。EspF是EHEC通过III型分泌系统分泌的效应蛋白，主要负责炎症性结肠炎的发展。我们先前的研究表明，EspF与宿主膜联蛋白A6（ANXA6）相互作用，并靶向内质网（ER）。鉴于ER应激对胃肠炎宿主反应的关键影响，我们探讨了EspF-ANXA6相互作用在ER应激中的作用。用不同EHEC菌株感染Caco-2细胞，并转染修饰质粒以建立体外研究模型。我们的结果表明，感染espF缺失的EHEC菌株显著加剧了ER应激。具体来说，eIF2α的磷酸化升高，BiP、ATF4和CHOP的表达水平与野生型EHEC菌株感染的细胞相比增加了超过15%。进一步的实验表明，EspF与BiP共定位，并下调PERK通路。同时，EspF-ANXA6相互作用可加剧PERK通路的抑制，并刺激钙内流以干扰ER稳态，最终导致细胞凋亡。我们的研究结果表明，EspF-ANXA6相互作用可通过PERK通路抑制ER应激，这可能限制细胞间通讯并阻断宿主细胞对细菌的清除。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EspF-ANXA6相互作用在EHEC O157:H7感染诱导的肠上皮细胞内质网应激中起什么作用？
- 核心机制
- EspF与ANXA6相互作用抑制PERK通路，减少eIF2α磷酸化，下调ATF4和CHOP表达，从而抑制内质网应激；同时刺激钙离子释放，破坏钙稳态，诱导细胞凋亡。
- 主要证据
- Caco-2细胞感染espF缺失菌株导致BiP、ATF4、CHOP表达显著升高及eIF2α磷酸化增强；质粒转染显示EspF与BiP共定位，且EspF-ANXA6融合蛋白抑制PERK通路、增加细胞内钙浓度并诱导细胞凋亡。
- 研究意义
- 该研究揭示了EspF-ANXA6相互作用通过PERK通路抑制内质网应激、扰乱宿主细胞功能并促进细菌存活的新机制，为开发治疗EHEC O157:H7感染的新策略提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EspF与BiP共定位分析
验证EspF是否与内质网应激标志蛋白BiP共定位
将pEGFP (E)、pEGFP-EspF (EE)或pEYFP-EspF-T2A-ANXA6 (EYEA)转染Caco-2细胞48小时，通过免疫荧光和共聚焦显微镜分析EspF与BiP的共定位情况。
EspF-ANXA6对PERK通路的影响
评估EspF单独或与ANXA6相互作用对PERK通路及下游蛋白的影响
转染EE或EYEA质粒至Caco-2和HeLa细胞48小时，通过Western blot检测BiP、ANXA6、CHOP、eIF2α、p-eIF2α和ATF4的表达水平。
钙离子释放与细胞凋亡检测
确定EspF-ANXA6相互作用对细胞内钙水平及细胞凋亡的影响
转染相应质粒48小时后，使用RHOD-2/AM荧光染料和共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度；用Annexin V-633/PE凋亡检测试剂盒和流式细胞术分析细胞凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细菌感染 | LB肉汤 | 文中未明确说明 | -- |
| 卡那霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot | 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | -- |
| RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Bimake | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗BiP抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | -- | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Proteintech | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | Proteintech | -- | |
| ECL化学发光底物试剂盒 | Millipore | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| DAPI核酸染料 | -- | -- | |
| 钙成像 | Hank's平衡盐溶液 | Bioss | -- |
| RHOD-2/AM钙离子荧光探针 | Yeasen | -- | |
| 泊洛沙姆 | Yeasen | -- | |
| 凋亡检测 | 633凋亡检测试剂盒 | DOJINDO | -- |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 流式细胞术 | BD多维高清流式细胞分析仪 | BD Biosciences | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
| 统计分析 | SPSS统计软件 | SPSS Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系：Caco-2、HeLa；培养基：DMEM含10%FBS和1%青霉素/链霉素；转染试剂：Lipofectamine 3000；转染质粒及浓度 阅读提示：见Materials and Methods 2.1 |
| 细菌感染 | 菌株：野生型EHEC O157:H7 EDL933、ΔespF突变株；MOI：100；感染时间：6h；培养基：含2%血清的无抗生素DMEM 阅读提示：见Materials and Methods 2.2及Results 3.1 |
| Western Blot | 抗体：抗BiP、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、β-actin；稀释比例：1:1000；二抗：山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG；蛋白上样量 阅读提示：见Materials and Methods 2.3 |
| 免疫荧光 | 转染后固定、通透、封闭条件；一抗孵育时间；DAPI染色时间；共聚焦显微镜型号及放大倍数 阅读提示：见Materials and Methods 2.4 |
| 钙成像与凋亡检测 | RHOD-2/AM浓度、染色时间；凋亡检测试剂盒使用步骤；样品细胞浓度；流式细胞仪分析参数 阅读提示：见Materials and Methods 2.5和2.6 |