验证FMDV感染对糖酵解的激活
确定FMDV感染是否影响细胞糖酵解代谢。
用0.5 MOI FMDV感染PK-15细胞12小时，检测细胞外酸化率（ECAR）和乳酸含量。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
口蹄疫病毒激活糖酵解并劫持HK2抑制先天免疫从而促进病毒复制
Foot-and-mouth disease virus activates glycolysis and hijacks HK2 to inhibit innate immunity and promote viral replication.
实验完整度
中包含体外细胞感染模型、代谢检测（ECAR、乳酸、ATP）、功能验证（2-DG抑制、HK2过表达）及机制验证（共定位、co-IP、自噬抑制剂）。但缺乏动物模型或患者样本等多层级验证。
主要模型
PK-15猪肾细胞系（体外感染模型） HEK293T细胞（用于蛋白相互作用验证） BHK-21细胞（用于FMDV扩增）
重点核对
FMDV感染剂量和时间（0.5 MOI，6-12小时） HK2过表达质粒（pCAGGS-HA-HK2，转染24小时） 2-DG处理浓度和时间（50 mmol/L，4小时预处理） 自噬抑制剂处理（bafilomycin A1和CQ，4小时） 病毒复制检测指标（VP1蛋白、3Dpol mRNA、TCID50）
摘要
口蹄疫严重制约了全球畜牧业的健康发展，而口蹄疫病毒（FMDV）的致病机制尚不明确，导致口蹄疫的防控和净化困难。糖酵解重塑被认为是病毒感染的特征之一，为病毒组装和复制提供能量和前体。本研究从免疫代谢的角度探讨了FMDV与糖酵解之间的相互作用和机制。我们发现FMDV感染增加了细胞外酸化率、乳酸积累和HK2水平。此外，在FMDV感染期间，HK2增强糖酵解活性，并介导IRF3/7的自噬降解，从而拮抗先天免疫反应，进而促进病毒复制。我们的研究结果提供了FMDV与宿主代谢密切相关的证据，加深了对糖酵解和HK2促进病毒感染的理解，并为进一步阐明FMDV的致病机制提供了新思路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FMDV感染如何通过影响宿主糖酵解代谢及关键酶HK2来调节先天免疫反应和病毒复制？
- 核心机制
- FMDV感染激活糖酵解并上调HK2；HK2通过促进自噬流，介导IRF3/IRF7经自噬-溶酶体途径降解，抑制干扰素相关细胞因子的产生，从而拮抗先天免疫应答并促进病毒复制。
- 主要证据
- PK-15细胞感染FMDV后检测到ECAR、乳酸和HK2表达升高；HK2过表达增强糖酵解和病毒复制，而2-DG抑制糖酵解降低病毒复制；HK2与IRF3/IRF7共定位并共沉淀，自噬抑制剂（CQ、巴弗洛霉素A1）逆转HK2诱导的IRF3/IRF7降解和细胞因子抑制，自噬激活剂雷帕霉素则加剧降解。
- 研究意义
- 研究揭示了FMDV通过调控宿主代谢（糖酵解和自噬）逃逸免疫应答的新机制，加深了对病毒感染、代谢与自噬之间调控关系的理解，为阐明FMDV致病机制和开发防控策略提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测HK2表达变化
考察FMDV感染是否影响糖酵解关键酶HK2的表达。
PK-15细胞感染FMDV不同时间（0、3、6、12小时），检测HK2 mRNA和蛋白水平。
验证HK2对糖酵解和病毒复制的影响
确定HK2是否通过影响糖酵解来调节FMDV复制。
过表达HK2或使用2-DG抑制糖酵解，检测乳酸、ATP、ECAR水平以及病毒复制指标（VP1蛋白、3Dpol mRNA、病毒滴度）。
筛选与HK2互作的FMDV蛋白
寻找介导HK2对FMDV复制影响的病毒蛋白。
共转染HK2与FMDV各蛋白表达质粒，通过共定位和co-IP检测相互作用。
验证HK2通过自噬对先天免疫的影响
探究HK2是否通过自噬抑制干扰素相关细胞因子表达从而促进病毒复制。
过表达HK2后感染FMDV，检测LC3斑点、mRFP-eGFP-LC3荧光变化、细胞因子mRNA水平，并使用自噬抑制剂处理。
验证HK2与IRF3/IRF7的相互作用及降解机制
阐明HK2抑制IRF3/IRF7表达的分子机制。
通过共定位、co-IP检测HK2与IRF3/IRF7相互作用，并检测HK2对IRF3/IRF7表达的影响；使用自噬调节剂处理观察IRF3/IRF7降解。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测糖酵解代谢
检测基因和蛋白表达
验证蛋白相互作用
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | Macklin | D807272 |
| 雷帕霉素 | MedChemExpress | HY-10219 | |
| 巴弗洛霉素A1 | MedChemExpress | HY-100558 | |
| 氯喹 | MedChemExpress | HY-17589A | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11995040 |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10099 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| Western blot | 抗HK2抗体 | Proteintech | 2A11C3 |
| 抗FMDV VP1抗体 | Bioss | bs-41049R | |
| 抗p62抗体 | Cell Signaling Technology | 8025 | |
| 抗LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 2775 | |
| 抗β-actin抗体 | Abmart | TP70573 | |
| 细胞裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012 | |
| 5×SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime Biotechnology | P0015L | |
| 增强化学发光试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0018 | |
| CanoScan LiDE 100扫描系统 | Canon | -- | |
| qRT-PCR | 总RNA提取试剂盒I | Omega | R6834-02 |
| HiScript II Q RT SuperMix | Vazyme | R223-01 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 | |
| iQ5 iCycler检测系统 | Bio-Rad | 1855200 | |
| 免疫荧光 | 35毫米玻底培养皿 | NEST | GBD-35-20 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | |
| 徕卡TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒感染 | 细胞系（PK-15）和病毒株（O/BY/CHA/2010）来源；感染剂量（0.5 MOI）和时间（6-12小时） 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and viral infection；Figure legends |
| 糖酵解检测 | ECAR、乳酸和ATP检测的具体试剂盒和操作流程 阅读提示：Results - FMDV infection induced glycolytic metabolism；图1、图2图注 |
| HK2过表达和2-DG处理 | 过表达质粒（pCAGGS-HA-HK2）转染浓度和时间；2-DG处理浓度（50 mmol/L）和处理时间（4小时） 阅读提示：Results - The glycolytic metabolic enzyme HK2 promoted FMDV replication；图2图注 |
| 自噬检测与调控 | 自噬抑制剂（bafilomycin A1、CQ）和激活剂（rapamycin）的浓度和处理时间；LC3斑点和mRFP-eGFP-LC3荧光检测条件 阅读提示：Results - HK2 promoted FMDV replication by inhibiting...；图4、图5图注 |
| 蛋白相互作用验证 | 共聚焦显微镜和co-IP的具体步骤，包括抗体和洗脱条件 阅读提示：Materials and methods - Confocal immunofluorescence microscopy；Results - HK2 interacted with IRF3/IRF7；图6图注 |