DRAM系统构建与验证
构建DRAM、DRAMmut和Deaminase系统，并验证m5C阅读蛋白对m5C RNA的特异性结合。
将ALYREF和YBX1分别与APOBEC1和TadA-8e融合，构建DRAM-ABE和DRAM-CBE系统。通过RNA pull-down实验验证ALYREF和YBX1对m5C修饰RNA的偏好性，并验证关键氨基酸突变（YBX1 W65-N70缺失、ALYREF K171A）降低其m5C结合能力。
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通过脱氨酶和阅读蛋白辅助测序进行转录组范围的5-甲基胞嘧啶鉴定
Transcriptome-wide identification of 5-methylcytosine by deaminase and reader protein-assisted sequencing.
实验完整度
高包含体外RNA pull-down、细胞系功能验证（敲除NSUN2/NSUN6）、转录组测序（DRAM-seq）及低输入检测，多个独立证据层级。
主要模型
HEK293T细胞系 NSUN2敲除HEK293T细胞系 NSUN6敲除HEK293T细胞系
重点核对
DRAM、DRAMmut和Deaminase系统分别转染HEK293T细胞 DRAM-ABE和DRAM-CBE编辑效率的检测位点：RPSA和AP5Z1 mRNA NSUN2和NSUN6敲除细胞系中编辑效率降低 DRAM-seq编辑事件筛选标准：编辑比例10%-60%，对照样本编辑比例至少为NSUN2/NSUN6敲除样本的2倍，每个位点至少4个编辑事件
摘要
5-甲基胞嘧啶（m5C）是mRNA中的一种转录后修饰，并参与多种疾病的发病机制。然而，现有检测方法在准确、全面地绘制转录组范围的m5C图谱方面的能力仍有待提高。在此，我们开发了一种名为DRAM（脱氨酶和阅读蛋白辅助RNA甲基化分析）的检测方法，其中脱氨酶（APOBEC1和TadA-8e）与m5C阅读蛋白（ALYREF和YBX1）融合，通过甲基化位点附近的脱氨事件来鉴定m5C位点。这种不依赖抗体、不依赖亚硫酸氢盐的方法可提供转录组范围的编辑区域，这些区域与公开可用的亚硫酸氢盐测序（BS-seq）数据集高度重叠，并且能够更稳定、更全面地鉴定m5C位点。此外，DRAM系统甚至支持超低输入RNA（10 ng）。我们预计DRAM系统可以为揭示m5C修饰的进一步生物学功能铺平道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种无需抗体和亚硫酸氢盐、能够稳定全面鉴定转录组范围m5C位点的新方法？
- 核心机制
- 利用m5C阅读蛋白（ALYREF和YBX1）特异性识别m5C位点，将脱氨酶（APOBEC1和TadA-8e）招募至邻近区域，诱导C-to-U或A-to-G突变，通过检测这些突变来推断m5C位点。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中，DRAM-ABE和DRAM-CBE分别在RPSA和AP5Z1 mRNA的m5C位点附近诱导A-to-G（14.7%）和C-to-U（13.6%）编辑，而DRAMmut或仅脱氨酶系统编辑效率显著降低；NSUN2或NSUN6敲除后编辑减少；DRAM-seq编辑位点与BS-seq数据集重叠率分别为79.6%和91.9%。
- 研究意义
- DRAM-seq提供了一种更稳定、全面的m5C转录组检测方法，并支持低输入RNA（10 ng），有望揭示m5C的生物学功能并促进相关疾病治疗干预的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
m5C依赖性验证
验证DRAM系统的编辑依赖于m5C位点的存在。
将DRAM、DRAMmut和Deaminase分别转染HEK293T细胞，通过RT-PCR和Sanger测序检测已知m5C位点（RPSA和AP5Z1）附近的编辑事件。在NSUN2或NSUN6敲除细胞中，检测DRAM诱导的编辑是否减少。
转录组范围m5C检测（DRAM-seq）
利用DRAM-seq进行全转录组m5C位点的检测和分析。
转染DRAM后进行RNA-seq，通过检测C-to-U/A-to-G编辑事件鉴定m5C位点。将DRAM-seq编辑位点与已发表的BS-seq数据进行比较，分析编辑位点在转录本上的分布。
低输入RNA检测
评估DRAM系统在低输入RNA条件下的检测能力。
使用不同量（250 ng、50 ng、10 ng）的总RNA进行RT-PCR和Sanger测序，检测RPSA和AP5Z1 mRNA中m5C位点附近的DRAM诱导编辑。
细胞活力检测
评估DRAM表达对HEK293T细胞活力的影响。
使用CCK8试剂盒检测转染DRAM后HEK293T细胞的增殖能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
| Fast定点突变试剂盒 | TIANGEN Biotech | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | CLARK BIOSCIENCE | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | Hieff Trans脂质体转染试剂 | Yeasen | -- |
| 细胞系构建 | 嘌呤霉素 | Meilunbio | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Meilunbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Boster | -- | |
| 脱脂牛奶 | Boster | -- | |
| NSUN2多克隆抗体 | Proteintech | 20854-1-AP | |
| NSUN6多克隆抗体 | Proteintech | 17240-1-AP | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Bioss | bs-41373R | |
| α-微管蛋白多克隆抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L) | Beyotime Biotechnology | A0208 | |
| cDNA合成和Sanger测序 | TRIzol试剂 | TIANGEN Biotech | -- |
| PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| 2×Taq PCR预混液II | TIANGEN Biotech | -- | |
| 实时荧光定量PCR | FastKing RT试剂盒（含gDNase） | TIANGEN Biotech | -- |
| SuperReal PreMix Plus（SYBR Green） | TIANGEN Biotech | -- | |
| 蛋白质结构建模 | SWISS-MODEL | -- | -- |
| PyMOL | -- | -- | |
| BS-seq PCR | EZ RNA甲基化试剂盒 | Zymo Research | 50 |
| 2×EpiArt HS Taq预混液（含染料） | Vazyme | -- | |
| TIANgel中量纯化试剂盒 | TIANGEN Biotech | -- | |
| 文库构建 | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | E7530L |
| AMPure XP纯化系统 | Beckman Coulter | -- | |
| USER酶 | NEB | -- | |
| Agilent 5400系统 | Agilent | -- | |
| RNA pull-down | Pierce磁性RNA-蛋白质pull-down试剂盒 | Thermo | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | HEK293T细胞培养条件（DMEM+10% FBS+1%青霉素/链霉素）；转染试剂Hieff Trans；DRAM质粒浓度（1500 ng、1000 ng、500 ng） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and plasmid transfection; Figure 5E-H |
| DRAM编辑效率检测 | 检测位点：RPSA和AP5Z1 mRNA；DRAM-ABE和DRAM-CBE编辑效率；Sanger测序分析（n=3） 阅读提示：Results: DRAM detection system is assayed in an m5C-dependent form; Figure 2C-D |
| BS-seq PCR | RNA亚硫酸氢盐处理条件（70°C 5 min，54°C 45 min）；深测序reads数>1000 阅读提示：Materials and methods: BS-seq PCR; Figure 2A-B |
| DRAM-seq分析 | 编辑事件筛选参数：覆盖≥10 reads，编辑比例5%-95%，编辑比例至少1.5倍高于敲除样本，每个位点至少2个编辑事件；高置信度筛选：编辑比例10%-60%，对照样本编辑比例至少2倍于敲除，每个位点至少4个编辑事件 阅读提示：Materials and methods: DRAM-seq analysis and calling of edited sites; Figure 3F |