体外细胞毒性评估
确定RSG对软骨细胞的安全浓度范围以及对ACSL4表达的影响。
使用CCK-8检测不同浓度RSG（0-200 μM）处理24和48小时后的细胞活力，并用Western blot和qPCR检测ACSL4表达，用甲苯胺蓝染色观察细胞形态。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
罗格列酮通过阻碍软骨细胞铁死亡延缓铁过载诱导的骨关节炎进展
Rosiglitazone retards the progression of iron overload-induced osteoarthritis by impeding chondrocyte ferroptosis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（原代小鼠软骨细胞，IL-1β/FAC诱导）和体内动物模型（DMM手术+铁葡聚糖诱导IOOA），并进行了功能验证、机制验证和病理评估。
主要模型
原代小鼠软骨细胞 DMM手术诱导的OA小鼠模型 DMM手术联合铁葡聚糖诱导的IOOA小鼠模型 C57BL/6小鼠
重点核对
RSG浓度（50 μM用于体外） IL-1β浓度（10 ng/mL）和FAC浓度（100 μM） DMM手术及铁葡聚糖给药剂量（500 mg/kg/周） RSG关节腔注射剂量（0.1、0.2、0.3 mg/kg） 动物分组（n=8/组）和实验周期（8周）
摘要
铁死亡与多种疾病有关，包括以氧化应激、铁失衡和脂质过氧化为特征的铁过载诱导的骨关节炎（IOOA）。鉴于罗格列酮（RSG）抑制脂质过氧化和铁死亡的能力，本研究旨在评估其治疗IOOA的潜力。我们的体外结果表明，RSG靶向酰基辅酶A合成酶长链家族成员4，以减轻白介素-1β和柠檬酸铁铵诱导的损伤，包括细胞凋亡、衰老、炎症反应、细胞外基质降解和铁死亡。RSG降低了细胞内铁含量，减轻了氧化应激和脂质过氧化，减轻了膜结合细胞器的损伤，并增强了葡萄糖转运。此外，RSG预处理赋予软骨细胞抗铁死亡特性。在体内，RSG减轻了IOOA小鼠的软骨退化、炎症反应和铁死亡。总之，RSG通过抑制脂质过氧化和恢复铁稳态发挥软骨保护和抗铁死亡作用，凸显其治疗IOOA的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 罗格列酮能否通过抑制软骨细胞铁死亡来延缓铁过载诱导的骨关节炎的进展？
- 核心机制
- RSG通过靶向抑制ACSL4活性，抑制脂质过氧化并恢复铁稳态，从而抑制软骨细胞铁死亡，发挥软骨保护作用。
- 主要证据
- 体外实验中，RSG降低IL-1β/FAC诱导的细胞内铁含量、ROS和脂质过氧化，上调GPx4等抗铁死亡标志物，下调ACSL4等促铁死亡标志物；体内实验中，RSG减轻DMM/IOOA小鼠的软骨退化、炎症和铁死亡相关蛋白表达。
- 研究意义
- RSG是治疗IOOA的有前景的抗铁死亡候选药物，可能缩短从实验室研究到临床应用的时间。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能验证
验证RSG对IL-1β/FAC诱导的软骨细胞增殖抑制、凋亡和衰老的保护作用。
使用EdU、Calcein-AM/PI、Annexin V-FITC/PI和β-半乳糖苷酶染色评估细胞增殖、活/死、凋亡和衰老。
体外分子表达分析
检测RSG对IL-1β/FAC诱导的炎症因子、ECM降解酶和铁死亡标志物表达的影响。
使用qPCR和Western blot检测炎症因子（TNF-α、COX-2、iNOS、IL-6）、ECM降解酶（MMP3、MMP13、ADAMTS5）和铁死亡相关基因（GPx4、SLC7A11、RGS4、ACSL4、TfR1、CHAC1）的表达，并用ELISA检测部分蛋白水平。
细胞内铁含量和氧化应激检测
评估RSG对IL-1β/FAC诱导的细胞内铁积累和氧化应激的影响。
使用FerroOrange和Mito-FerroGreen荧光探针检测细胞质和线粒体Fe2+，使用流式细胞术和荧光显微镜；使用mtSOX Deep Red检测线粒体ROS，DCFH-DA检测总ROS；检测谷氨酸、谷氨酰胺、GSH、GSSG和SOD活性。
脂质过氧化检测
评估RSG对IL-1β/FAC诱导的软骨细胞脂质过氧化的影响。
使用Liperfluo、C11 BODIPY581/591荧光探针检测脂质过氧化物，使用MDA检测试剂盒和4-HNE ELISA试剂盒。
细胞器损伤评估
评估RSG对IL-1β/FAC诱导的线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体损伤的影响。
使用透射电镜观察线粒体超微结构，使用Rhodamine 123和JC-1检测线粒体膜电位，使用LysoTracker red、Mito-Tracker Green、ER-Tracker Green和Golgi-Tracker Red检测细胞器质量。
RSG预处理赋予抗铁死亡特性
验证RSG预处理是否能增强软骨细胞对铁死亡诱导剂的抵抗力。
用50 μM RSG预处理软骨细胞24小时，然后用不同浓度的Erastin（0.1/1/5 μM）或FAC（100/200/400 μM）处理24小时，通过免疫荧光检测ACSL4、GPx4、TfR1表达，通过普鲁士蓝染色检测铁沉积。
葡萄糖转运检测
评估RSG对软骨细胞葡萄糖摄取和GLUT1表达的影响。
使用葡萄糖检测试剂盒检测细胞内葡萄糖含量，用Western blot检测GLUT1表达。
ACSL4敲低和分子对接
验证ACSL4在RSG作用中的靶点作用。
使用siRNA敲低ACSL4，检测铁死亡、炎症和ECM降解相关蛋白表达；通过分子对接预测RSG与ACSL4的结合。
体内疗效评估
评估RSG对DMM/IOOA小鼠模型软骨退化的影响。
建立DMM手术和铁葡聚糖注射诱导的IOOA模型，通过micro-CT、组织学染色（H&E、TB、SOFG）和评分评估软骨退化。
体内分子变化分析
评估RSG对IOOA小鼠软骨中炎症、ECM降解和铁死亡标志物表达的影响。
通过免疫组化检测4-HNE、ACSL4、ADAMTS5、COX-2、TfR1、GPx4、MMP3和Nrf2的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 完全DMEM/F12培养基 | Procell | PM150310B |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Servicebio | G4001 | |
| 药物处理 | 罗格列酮 | Rhawn | R014317 |
| Erastin | Macklin | E872563 | |
| 柠檬酸铁铵 | Rhawn | R017760 | |
| 重组小鼠白介素-1β | PeproTech | 211-11B | |
| 动物实验 | 铁葡聚糖 | Macklin | I812123 |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | Solarbio | D8371 |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| 细胞增殖检测 | BeyoClick™ EdU细胞增殖试剂盒（Alexa Fluor 555） | Beyotime | C0075S |
| 细胞活/死检测 | Calcein-AM/PI双染试剂盒 | Dojindo | C542 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡检测试剂盒 | Dojindo | AD10 |
| 衰老检测 | 衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Solarbio | G1580 |
| 铁含量检测 | 亚铁离子含量检测试剂盒 | Solarbio | BC5410 |
| 铁染色 | 细胞普鲁士蓝铁染色试剂盒 | Solarbio | G1426 |
| 铁探针 | FerroOrange荧光探针 | Dojindo | F374 |
| Mito-FerroGreen荧光探针 | Dojindo | M489 | |
| 氧化应激检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| mtSOX Deep Red荧光探针 | Dojindo | MT14 | |
| 脂质过氧化检测 | 脂质过氧化探针BDP 581/591 C11 | Dojindo | L267 |
| Liperfluo荧光探针 | Dojindo | L248 | |
| MDA检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Beyotime | S0131S |
| 谷氨酸检测 | 谷氨酸含量检测试剂盒 | Solarbio | BC1585 |
| 谷氨酰胺检测 | 谷氨酰胺含量检测试剂盒 | Geruisi | G0429W |
| SOD检测 | 超氧化物歧化酶活性检测试剂盒 | Solarbio | BC5165 |
| 线粒体膜电位检测 | 线粒体膜电位检测试剂盒（Rhodamine 123） | Beyotime | C2008S |
| 线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1） | Beyotime | C2006 | |
| 细胞器染色 | Mito-Tracker Green荧光探针 | Beyotime | C1048 |
| LysoTracker red荧光探针 | Beyotime | C1046 | |
| ER-Tracker Green荧光探针 | Beyotime | C1042S | |
| Golgi-Tracker Red荧光探针 | Beyotime | C1043 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Servicebio | G2033 |
| 10% SDS-PAGE凝胶 | Biotides | WB1102 | |
| 超敏ECL化学发光底物 | Biosharp | BL520B | |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | KGB2101 |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Beibei Biotechnology | 082001 |
| 逆转录 | PrimeScript™ RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047A |
| qPCR | TB Green® Premix DimerEraser™ | Takara | RR091A |
| ELISA | 小鼠4-羟基壬烯醛ELISA试剂盒 | FineTest | EM1583 |
| 小鼠白介素-6 ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00008 | |
| 小鼠环氧化酶-2 ELISA试剂盒 | ABclonal | RK03142 | |
| 小鼠肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00027 | |
| 小鼠一氧化氮合酶2 ELISA试剂盒 | FineTest | EM0272 | |
| 小鼠磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（GPx4）ELISA试剂盒 | FineTest | EM1964 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Beyotime | C1005 |
| siRNA转染 | GP-transfect-Mate转染试剂 | GenePharma | G04009 |
| 葡萄糖检测 | 葡萄糖检测组织裂解液 | Beyotime | S3062 |
| 组织学染色 | 甲苯胺蓝软骨染色液 | Servicebio | G1032 |
| 番红O和快绿染色液 | Servicebio | G1053 | |
| 免疫组化 | 超敏SP免疫组化试剂盒 | MXB Biotechnologies | KIT-9710 |
| DAB染色液 | Servicebio | G1212 | |
| 动物麻醉 | 异氟烷 | RWD Life Science | R510-22 |
| 显微CT | vivaCT 80显微CT | SCANCO MEDICAL | -- |
| 荧光显微镜 | DMi8倒置荧光显微镜 | Leica | -- |
| 流式细胞仪 | CytoFLEX S流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 透射电镜 | HT7700透射电镜 | Hitachi | -- |
| 微孔板读数仪 | Multiskan FC酶标仪 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外药物处理 | RSG浓度（50 μM）、IL-1β浓度（10 ng/mL）、FAC浓度（100 μM）、处理时间（IL-1β/FAC 24h，RSG 24h） 阅读提示：STAR★Methods, 'Chondrocytes preparation and treatment' 部分 |
| 细胞增殖和凋亡检测 | EdU孵育时间（2h）、Calcein-AM/PI孵育时间（15min）、Annexin V/PI孵育时间（15min） 阅读提示：Figure legends 2 A-F和STAR★Methods中相应段落 |
| 铁含量和氧化应激检测 | FerroOrange/Mito-FerroGreen孵育时间（30min）、DCFH-DA孵育时间（20min）、mtSOX Deep Red孵育时间（30min） 阅读提示：STAR★Methods, 'Intracellular iron assay' 和 'Detection of reactive oxygen species (ROS) and lipid peroxidation' |
| 体内模型建立 | 动物品系（C57BL/6雄性）、年龄（6周龄）、分组（n=8）、DMM手术、铁葡聚糖剂量（500 mg/kg/周）、RSG剂量（0.1/0.2/0.3 mg/kg）和给药方式（关节腔注射） 阅读提示：STAR★Methods, 'Animal experiments' 部分 |
| 组织学评估 | 脱钙时间（1周）、切片厚度（4μm）、染色方法（HE、TB、SOFG）、评分系统（OARSI和改良Mankin）、软骨厚度测量 阅读提示：STAR★Methods, 'Histological staining' 部分和Figure legends 8C-H |