冷诱导RNA结合蛋白在小鼠脊髓损伤模型中的表达

Expression of cold-inducible RNA-binding protein in mouse spinal cord injury model.

作者信息Xinhui Zhang, Yi Zhao, Jing Guo, Jingkun Chen, Xue Gao, Wentao Pan, Hengli Li, Shutong Yao, Yueying Zhang
PMID40036292
期刊PLoS One
发布时间2025-03-04
DOI10.1371/journal.pone.0311803

实验完整度

中

包含动物模型构建、行为学评分、HE/Nissl染色、免疫荧光检测等实验层级,但缺乏功能获得/丧失验证及下游机制实验。

主要模型

C57BL/6小鼠脊髓损伤模型(重度损伤组) 脊髓离断模型

重点核对

小鼠品系与性别:成年雌性C57BL/6小鼠,20-25 g,n=75 脊髓损伤建模方法:T10椎板切除术,脊髓撞击器(68100,RWD)撞击,损伤深度与时间 分组:Sham、轻度、中度、重度、完全损伤组,每组15只 检测时间点:建模后1、3、5、14、21天 免疫荧光检测指标:NeuN、IBA-1、CIRBP

摘要

目的:探讨冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)在小鼠脊髓损伤模型中的表达变化。方法:将75只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,每组15只。根据脊髓损伤程度不同,分为轻度脊髓损伤组、中度脊髓损伤组、重度脊髓损伤组、脊髓离断组和假手术组,均采用脊髓撞击法构建。各组在建模后1、3、5、14和21天进行解剖。采用HE染色观察脊髓病理变化,采用Basso小鼠量表(BMS)进行运动功能评分,采用免疫荧光检测脊髓组织中NeuN、IBA-1和CIRBP的表达。结果:HE结果显示,与假手术组相比,中度、重度和离断损伤组的炎症更明显。中度损伤组和重度损伤组的炎症随时间持续增加。重度损伤组组织结构破坏严重,星形胶质细胞显著增加。结合小鼠BMS运动功能评分,小鼠重度损伤组模型更稳定。与假手术组相比,重度损伤组NeuN随时间显著降低(P < 0.01),IBA-1和CIRBP显著升高(P < 0.01)。此外,IBA-1与CIRBP具有显著共定位。结论:CIRBP在小鼠脊髓损伤模型中表达显著升高,这可能与脊髓损伤过程中小胶质细胞的增殖有关。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
CIRBP在小鼠脊髓损伤模型中的表达变化及其可能的作用是什么?
核心机制
CIRBP可能作为促炎因子,与小胶质细胞增殖相关,参与脊髓损伤后的炎症反应。
主要证据
免疫荧光显示重度损伤组CIRBP表达显著升高,且与IBA-1共定位,同时NeuN降低、IBA-1升高。
研究意义
作者提出CIRBP可能是脊髓损伤的关键促炎因子,靶向CIRBP有望成为脊髓损伤的临床治疗手段。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

构建小鼠脊髓损伤模型

建立不同损伤程度的脊髓损伤模型,并评估其稳定性。

对75只成年雌性C57BL/6小鼠进行T10椎板切除术,使用脊髓撞击器以不同深度和相同停留时间(0.4s)和速度(1-2m/s)构建轻度、中度、重度和完全损伤模型,假手术组仅暴露不撞击。术后给予青霉素和人工排尿护理。

2

行为学评估

评估不同损伤程度小鼠的运动功能恢复情况。

术前和术后各时间点使用BMS量表对小鼠后肢运动功能进行双盲评分,由两名未参与实验的人员观察。

3

组织病理学染色

观察脊髓组织病理变化,评估损伤程度。

取T10脊髓组织,固定、脱水、石蜡包埋、切片(4μm),进行HE染色和Nissl染色,观察组织结构和神经元变化。

4

免疫荧光检测蛋白表达

检测脊髓组织中NeuN、IBA-1和CIRBP的表达及共定位。

对石蜡切片进行抗原修复、封闭,孵育一抗(NeuN、IBA-1、CIRBP)和二抗(488和594),DAPI封片,使用3D病理切片扫描仪观察。

5

TUNEL染色检测神经元凋亡

检测神经元凋亡情况。

在NeuN免疫荧光后,使用TUNEL工作液孵育,DAPI封片,观察凋亡细胞。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

构建脊髓损伤模型
蛋白表达检测
细胞凋亡检测

产品清单

实验环节名称品牌货号
青霉素----
脊髓撞击器RWD68100
伊红----
亚甲基蓝染色液SolarbioG1303
EDTA抗原修复液----
山羊血清----
抗NeuN抗体Abcam104224
抗CIRBP抗体Biossbs-7790R
抗IBA1抗体Abcam5076
山羊抗小鼠488AffinityS0018
山羊抗兔594AffinityS0006
含DAPI封片剂----
TUNEL工作液Beyotimec1086
3D病理切片扫描仪----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型构建
小鼠品系、性别、体重、数量;麻醉剂量;手术节段;撞击深度、停留时间、速度;分组方式
阅读提示:参见 Methods 2.2 Construction of mouse spinal cord injury model,Table 1
行为学评估
BMS评分时间和方式;双盲评分人员要求
阅读提示:参见 Methods 2.3 Behavioral test
组织病理学染色
组织取材位置;固定液成分与时间;脱水梯度与时间;切片厚度;染色时间与试剂
阅读提示:参见 Methods 2.4 Tissue processing,2.5 Hematoxylin-eosin staining,2.6 Nissl stain
免疫荧光
抗原修复方式与时间;封闭条件;一抗名称、稀释度、孵育条件;二抗信息;封片剂
阅读提示:参见 Methods 2.7 Immunofluorescence
TUNEL染色
TUNEL试剂盒;孵育条件;复染方式
阅读提示:参见 Methods 2.8 Tunel staining