样本收集与准备
获取CRC患者和健康对照的血清样本，用于代谢组学和蛋白质组学分析。
从30名CRC患者和30名健康志愿者采集血液，离心获得血清，储存于-80°C。
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基于代谢组学和蛋白质组学的疾病诊断分类器模型用于结直肠癌的预测和诊断
Metabolomics- and Proteomics-Based Disease Diagnostic Classifier Model for the Prediction and Diagnosis of Colorectal Carcinoma.
实验完整度
中包含代谢组学、蛋白质组学、IHC验证及机器学习模型构建与验证，但IHC仅验证四个蛋白，样本量较小，缺少体内功能实验。
主要模型
CRC患者血清样本 健康对照血清样本 CRC组织和癌旁组织
重点核对
样本分组：30例CRC患者 vs 30例健康对照 训练/验证集划分：7:3比例（42 vs 18） 代谢组学QC：RSD≤30% IHC验证蛋白：CILP2, EXTL2, HYI, SLC3A2
摘要
背景：结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因。诊断生物标志物对于风险分层和早期检测至关重要，可能提高患者生存率。我们的研究旨在从蛋白质和代谢水平探索CRC的潜在生物标志物。方法：采用代谢组学和蛋白质组学技术分析CRC患者和健康对照者的血清。进行联合分析，并将样本按7:3比例分为训练集和验证集，以开发和评估疾病诊断分类器模型。进行免疫组织化学（IHC）分析以验证结果。结果：我们在CRC中鉴定了631种差异代谢物和61种差异表达蛋白（DEPs），涉及精氨酸和脯氨酸代谢、癌症中枢碳代谢等通路，以及TGF-β、mTOR、PI3K-Akt等信号通路。关键蛋白（CILP2、SLC3A2、EXTL2、HYI、ENPEP、LRG1、CTSS、TRHDE、SELE和HSPA1A）在CRC患者和对照者之间表现出显著表达差异。IHC结果显示，与癌旁组织相比，CRC组织中CILP2、EXTL2和HYI的表达显著下调（P < 0.05）。由l-精氨酸、Harden–Young酯、l-天冬氨酸、草酰乙酸、l-脯氨酸、章鱼胺、l-缬氨酸和孕酮组成的分类器模型在训练和验证数据集中AUC值分别为0.998和0.914。结论：鉴定的代谢物和DEPs是有前景的CRC生物标志物。基于八种代谢物开发的分类器模型对CRC评估和诊断表现出高准确性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索结直肠癌在蛋白质和代谢水平的潜在生物标志物，并开发疾病诊断分类器模型。
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 基于血清样本的代谢组学和蛋白质组学分析，鉴定631种差异代谢物和61种DEPs；通过IHC验证CILP2、EXTL2、HYI在CRC组织中表达下调；基于八种代谢物构建的分类器模型在训练和验证集中AUC分别为0.998和0.914。
- 研究意义
- 作者提出这些代谢物和DEPs是CRC的潜在生物标志物，基于八种代谢物的分类器模型对CRC评估和诊断具有高准确性，为CRC诊断和治疗策略提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代谢组学分析
鉴定CRC患者与健康对照之间的差异代谢物。
对血清样本进行UPLC-MS检测，数据预处理，筛选差异代谢物（P<0.05, VIP>1），并进行KEGG富集分析。
蛋白质组学分析
鉴定CRC患者与健康对照之间的差异表达蛋白（DEPs）。
从血清样本中提取蛋白质，进行DIA质谱分析，筛选DEPs（P<0.05, FC>1.2或<0.83），并注释。
机器学习筛选关键蛋白与代谢物
筛选用于诊断模型的关键蛋白和代谢物。
使用LASSO、SVM-RFE和RF算法筛选关键DEPs和代谢物，取交集。
关键蛋白的IHC验证
验证关键蛋白在CRC组织中的表达。
对CRC组织和癌旁组织进行IHC染色，检测SLC3A2、CILP2、EXTL2、HYI的表达。
诊断模型构建与验证
构建基于代谢物的疾病诊断分类器模型，并评估其性能。
将差异代谢物构建SVM分类器模型，并在训练和验证数据集中评估AUC。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 代谢组学检测 | 赛默飞Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| Orbitrap Exploris 120质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质组学分析 | Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Vanquish Neo液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| 免疫组化 | 抗SLC3A2抗体 | Sangon | -- |
| 抗CILP2抗体 | Bioss | -- | |
| 抗EXTL2抗体 | Bioss | -- | |
| 抗HYI抗体 | Sangon | -- | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)-HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 代谢组学数据预处理 | MSConvert工具 | Proteowizard | -- |
| 代谢组学数据处理 | XCMS软件 | R package | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | CRC患者和健康对照的纳入排除标准、年龄、性别、分期、样本量（每组30例，血清样本取100μL） 阅读提示：Materials and Methods 2.2 |
| 代谢组学检测 | 色谱柱型号、流动相、梯度洗脱程序、质谱参数（喷雾电压、鞘气、辅助气、毛细管温度、扫描范围、碰撞能量） 阅读提示：Materials and Methods 2.3 |
| 蛋白质组学分析 | 蛋白定量方法（BCA）、上样量（15μg）、SDS-PAGE条件、酶解方法、DIA-MS参数（窗口数、隔离窗口、碰撞能量） 阅读提示：Materials and Methods 2.4 |
| 机器学习模型 | 训练/验证集划分比例（7:3）、使用的代谢物列表、SVM核函数和交叉验证折数（10折） 阅读提示：Materials and Methods 2.6 |
| 免疫组化 | 抗体稀释比例、孵育时间（一抗4°C过夜，二抗37°C 30min）、DAB染色时间（1min）、复染时间（30s） 阅读提示：Materials and Methods 2.7 |
| 差异筛选阈值 | 代谢物筛选（P<0.05, VIP>1），蛋白筛选（P<0.05, FC>1.2或<0.83），相关系数阈值（|corr|>0.8, P<0.05） 阅读提示：Materials and Methods 2.8 and Results sections |