构建和验证circ-HDGFRP3的过表达质粒
设计并验证用于活细胞成像的circ-HDGFRP3-Pepper质粒，确保环化和表达效率。
将circ-HDGFRP3外显子2-5克隆到含ICS的载体中，并在外显子4或5插入4xPepper，构建p-circ-Ex4和p-circ-Ex5。通过qPCR检测circ和线性异构体表达，通过核质分离检测定位。
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利用Pepper荧光RNA对与FUS病理聚集体相关的环状RNA和长链非编码RNA进行活细胞成像
Live-cell imaging of circular and long noncoding RNAs associated with FUS pathological aggregates by Pepper fluorescent RNA.
实验完整度
高包含体外细胞模型（HEK293T、iPSC衍生MN、mESC衍生MN）与活细胞成像、smFISH、RNase R处理、超分辨SIM及单颗粒追踪等多个独立证据层级，并进行了功能验证（定位、相互作用）。
主要模型
HEK 293T细胞（转染p-circ或nHOTAIRM1-4xPepper，稳定表达GFP-G3BP1、GFP-FUSP525L或GFP-DCP1A） 小鼠胚胎干细胞（mESCs）来源的运动神经元（mMNs） 人诱导多能干细胞（iPSCs）来源的运动神经元（MNs）
重点核对
p-circ-Ex4和p-circ-Ex5构建体：需验证circ-HDGFRP3的环化效率及线性异构体水平（图1B）。 HBC620染料浓度（0.5 μM）和处理时间（5-30分钟）需优化以确保信噪比。 NaAsO2应激浓度（0.5 mM）和处理时间（1小时）需核实。 RNase R处理条件（10 U/孔，处理4小时）需标准化。 稳定细胞系选择：GFP-G3BP1、GFP-FUSP525L、GFP-DCP1A（blasticidin筛选）需验证表达。
摘要
近年来，在固定和活细胞中可视化RNA方面取得了重要进展。尽管mRNA成像技术已经很成熟，但开发研究非编码RNA（ncRNAs）的有效方法在活细胞中仍然具有挑战性，但又是必要的，因为它们显示出多种功能和细胞内定位，包括参与高度动态的过程，如相变，这在体内研究仍然很少。针对这一问题，我们用荧光RNA（fRNA）Pepper标记了两种代表性的ncRNA。具体来说，我们展示了circ-HDGFRP3与p-body相互作用，并以动态方式被招募到病理性的FUS聚集体中，通过结构照明显微镜超分辨了其在这种凝聚体中的分布。此外，我们追踪了长链非编码RNA（lncRNA）nHOTAIRM1，一种运动神经元特异性的应激颗粒组分，监测其在生理和病理条件下氧化应激反应过程中的行为。总的来说，随着fRNA的发展，我们的工作证明了Pepper在监测复杂过程（如相变）中的有效应用，通过可视化环状RNA（circRNAs）和lncRNAs并具有超分辨能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用荧光RNA（fRNA）Pepper在活细胞中可视化和追踪非编码RNA（circ-HDGFRP3和nHOTAIRM1）在与FUS病理聚集体相关的相分离过程中的动态行为？
- 核心机制
- circ-HDGFRP3与p-body相互作用并被招募到FUSP525L聚集体中，nHOTAIRM1在氧化应激下被招募到应激颗粒（SG）中，且该过程不依赖FUS突变；FUSP525L突变可能驱动nHOTAIRM1与p-body的相互作用。
- 主要证据
- 通过活细胞成像和单颗粒追踪显示circ-HDGFRP3与GFP-DCP1A和GFP-FUSP525L共定位；通过smFISH和免疫荧光显示nHOTAIRM1与G3BP1和FUSP525L共定位；通过RNase R处理证实信号主要来自环状RNA；通过SIM超分辨显示circ-HDGFRP3在FUS聚集体中的亚分布。
- 研究意义
- 证明了Pepper fRNA可用于活细胞中超分辨监测circRNAs和lncRNAs在相分离过程中的动态，为研究非编码RNA在神经退行性疾病中的作用提供了工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测活细胞中circ-HDGFRP3的荧光信号
验证p-circ-Ex4构建体在活细胞中产生特异性荧光信号。
转染p-circ-Ex4的HEK 293T细胞用HBC620染料染色，观察荧光聚焦点，并通过RNase R处理验证信号来源。
circ-Hdgfrp3与p-body的相互作用分析
确定circ-Hdgfrp3是否与p-body共定位。
使用BaseScope smFISH和免疫荧光在mESC来源的运动神经元中检测内源性circ-Hdgfrp3与DCP1A和TIAR的共定位；在HEK 293T细胞中表达GFP-DCP1A并转染p-circ-Ex4，进行活细胞成像和单颗粒追踪。
circ-HDGFRP3与FUSP525L聚集体的关联分析
检验circ-HDGFRP3是否与突变型FUS聚集体共定位，并验证特异性。
在稳定表达GFP-FUSP525L的HEK 293T细胞中表达circ-HDGFRP3-Pepper，进行活细胞成像和单颗粒追踪，并使用结构照明显微镜（SIM）超分辨成像。以ROMO1-4xPepper作为阴性对照。
nHOTAIRM1在生理和病理应激颗粒中的定位
研究nHOTAIRM1在氧化应激条件下是否被招募到应激颗粒。
在iPSC来源的运动神经元（WT和FUSP525L）中进行smFISH和免疫荧光，检测nHOTAIRM1与G3BP1和FUS的共定位。
nHOTAIRM1在活细胞中的动态招募
利用Pepper可视化nHOTAIRM1在应激颗粒形成过程中的动态行为。
在稳定表达GFP-G3BP1或GFP-FUSP525L的HEK 293T细胞中转染nHOTAIRM1-4xPepper，进行活细胞成像，观察相分离过程，并计算Manders系数和交集面积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| GlutaMAX | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| FuGENE HD | Promega | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | Geltrex | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Attachment factor X | Gibco | -- | |
| 分子克隆 | In-Fusion HD克隆试剂盒 | Takara Bio | -- |
| T4连接酶 | NEB | -- | |
| CloneAmp HiFi PCR预混液 | Clontech | -- | |
| RNA提取 | Direct-zol RNA小提试剂盒 | Zymo Research | -- |
| DNA去除试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 反转录 | PrimeScript RT预混液 | Takara Bio | -- |
| qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Quant-Studio 5 | Applied Biosystems | -- | |
| 活细胞成像 | HBC620 | FR biotechnology | -- |
| RNA酶处理 | RNase R | Biosearch Technologies | RNR07250 |
| mESC分化 | EmbryoMax DMEM | Sigma-Aldrich | -- |
| mESC培养 | 胚胎干细胞胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EmbryoMax 100X核苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| EmbryoMax非必需氨基酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ESGRO重组小鼠LIF蛋白 | Chemicon | -- | |
| PD173074 | Sigma-Aldrich | P2499 | |
| GSK-3抑制剂XVI | Sigma-Aldrich | 361559 | |
| mESC分化 | Advanced DMEM/F12 | Gibco | -- |
| Neurobasal培养基 | Gibco | -- | |
| Knock Out血清替代物 | Gibco | -- | |
| B27添加剂 | Gibco | -- | |
| 视黄酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SAG | Merck Millipore | -- | |
| GDNF | PeproTech | -- | |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington Biochemical Corporation | -- | |
| 卵类粘蛋白抑制剂 | Worthington Biochemical Corporation | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | -- | |
| 神经元培养 | N-2添加剂 | Gibco | -- |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 脑源性神经营养因子 | PeproTech | -- | |
| 睫状神经营养因子 | PeproTech | -- | |
| iPSC分化 | Accutase | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Nutristem-XF/FF培养基 | Biological Industries | -- | |
| ROCK抑制剂 | Enzo Life Sciences | -- | |
| Matrigel | BD Biosciences | -- | |
| 多西环素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | -- | |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | -- | |
| BaseScope | 蛋白酶III | Advanced Cell Diagnostics | 322381 |
| BaseScope检测试剂V2 - RED | Advanced Cell Diagnostics | 323910 | |
| RNAscope洗涤缓冲液试剂 | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| 免疫荧光 | 抗DCP1A抗体 | -- | ab183709 |
| 抗TIAR抗体 | BD Transduction | 610352 | |
| 山羊抗兔647 | Thermo Fisher Scientific | A32795 | |
| 核染色 | DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| 封片 | ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P-36961 |
| smFISH | 生物素化探针 | Sigma-Aldrich | -- |
| 钒氧核苷复合物 | Sigma-Aldrich | R3380 | |
| 去离子甲酰胺 | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| 硫酸葡聚糖 | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Alexa Fluor 568偶联链霉亲和素 | Invitrogen | S11226 | |
| 抗FUS抗体 | Bioss Antibodies | bs-2980R | |
| 抗FUS抗体 | Santa Cruz | sc-47711 | |
| 抗G3BP1抗体 | Sigma | GW22382A | |
| 抗G3BP1抗体 | Sigma | PLA0231 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| 山羊抗鸡Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32931 | |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | |
| 显微镜 | 奥林巴斯IX73显微镜 | Olympus | -- |
| CrestOptics X-LIGHT V3转盘系统 | CrestOptics | -- | |
| Prime BSI Express科学CMOS相机 | Photometrics | -- | |
| UPlanSApo 100× (NA 1.45)油镜 | Olympus | -- | |
| 尼康A1共聚焦激光显微镜 | Nikon | -- | |
| Plan Apo VC 100× Oil DIC N2 | Nikon | -- | |
| 活细胞成像 | Eclipse Ti2-E倒置显微镜 | Nikon | -- |
| N-STORM和N-SIM | Nikon | -- | |
| Apo TIRF 100×油镜 | Nikon | -- | |
| 3D EX V-R 100×/1.49光栅块 | Nikon | -- | |
| 软件 | MetaMorph软件 | Molecular Devices | -- |
| NIS-Elements AR软件 | Nikon | -- | |
| Fiji-ImageJ | -- | -- | |
| Origin Lab软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 质粒构建 | p-circ-Ex4和p-circ-Ex5的插入位点（外显子4和5），4xPepper序列长度（196 bp），circ-HDGFRP3序列（522 bp）。 阅读提示：详见Materials and Methods中的"Plasmid construction"部分 |
| 细胞培养和转染 | HEK 293T细胞培养条件（DMEM高糖、10% FBS、2 mM GlutaMAX、1%青霉素/链霉素），转染试剂（Lipofectamine 2000或FuGENE HD），DNA与转染试剂比例（1:2.5或1:2），使用的质粒量（2 μg）。 阅读提示：详见Materials and Methods中的"Cell maintenance and manipulation"和"Cell transfection and induction"部分 |
| 活细胞成像 | HBC620浓度（0.5 μM）和孵育时间（5-30分钟），成像培养基（FluoroBrite DMEM补充5 mM MgSO4），应激诱导NaAsO2浓度（0.5 mM）和处理时间（1小时）。 阅读提示：详见Materials and Methods中的"Live imaging of Pepper-tagged RNAs"部分 |
| RNase R处理 | RNase R用量（10 U/孔），处理时间（4小时），细胞通透化（0.05% Triton X-100/DPBS处理5分钟）。 阅读提示：详见Materials and Methods中的"RNase R treatment on live cells"部分 |
| 神经分化 | mESC和iPSC分化方案的具体条件（如RA浓度、SAG浓度、生长因子组合等），以及应激处理（NaAsO2浓度和时间）。 阅读提示：详见Materials and Methods中的"Differentiation of mESCs-derived MNs"和"Differentiation of iPSCs-derived MNs"部分 |