ST2表达与肺癌关联分析
分析ST2在肺癌组织中的表达及其与巨噬细胞标志物CD163的相关性。
对小鼠肺癌组织和患者样本进行免疫荧光、生存分析、相关性分析和空间转录组分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
IL-33/ST2信号通过调节交替活化巨噬细胞的极化促进肿瘤生长
IL-33/ST2 signalling promotes tumor growth by regulating polarization of alternatively activated macrophages.
实验完整度
高包含体外细胞实验（BMDM共培养、过表达、抑制剂）、体内动物模型（Lewis细胞移植瘤、原位癌模型）、患者样本（空间转录组、单细胞数据）及功能验证（增殖、侵袭、吞噬、T细胞功能），并进行了机制验证（PI3K/Akt通路）。
主要模型
Lewis小鼠肺癌细胞 骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 小鼠皮下移植瘤模型及原位肺癌模型 人肺腺癌组织样本
重点核对
小鼠基因型：WT、Il33Tg、Il33−/−、St2−/− 肿瘤细胞注射剂量：1×10^6（皮下）或2×10^5（原位） BMDM过表达构建：flIl33（1-266aa）和cIl33（109-266aa） 共培养时间：48小时 PI3K/Akt抑制剂（PI3K-IN-1，HY-12068）的使用
摘要
目的：抑制肿瘤生成性2（ST2）是白细胞介素（IL）-33的受体，在肿瘤生长、血管生成、转移和免疫调节中具有关键作用。已知IL-33/ST2通路影响巨噬细胞的极化和功能，这对于调节肿瘤微环境至关重要。然而，IL-33/ST2在肿瘤中的确切作用，特别是在非小细胞肺癌（NSCLC）中，尚未明确。方法：使用小鼠模型和患者标本分析NSCLC中ST2的表达。确定IL-33/ST2轴对NSCLC中巨噬细胞极化的影响。结果：ST2表达升高与侵袭性肿瘤生长相关。具体来说，巨噬细胞上的ST2表达与肺癌进展相关，而巨噬细胞上ST2缺失与肿瘤生长减弱相关。IL-33以ST2依赖性方式促进交替活化巨噬细胞的极化，该方式通过PI3K/Akt信号通路介导。此外，IL-33通过诱导交替活化巨噬细胞分泌转化生长因子β来抑制T细胞功能。结论：表达ST2的巨噬细胞可以成为NSCLC免疫治疗的有前景的治疗靶点，突出了IL-33/ST2轴作为未来抗肿瘤策略的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IL-33/ST2轴在非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤微环境中如何影响肿瘤生长及巨噬细胞极化？
- 核心机制
- IL-33以ST2依赖性方式通过激活PI3K/Akt信号通路促进巨噬细胞向交替活化（M2）表型极化，随后诱导TGF-β分泌，抑制T细胞功能，从而促进肿瘤生长。
- 主要证据
- 体外共培养实验显示IL-33过表达的Lewis细胞促进WT BMDM的AAM极化，而在St2−/− BMDM中无此效应；体内实验显示St2−/− BMDM转移抑制肿瘤生长；机制研究使用PI3K/Akt抑制剂验证通路参与。
- 研究意义
- 表达ST2的巨噬细胞可作为NSCLC免疫治疗的潜在靶点，IL-33/ST2轴为未来抗肿瘤策略提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
St2−/− BMDM对肿瘤生长的影响
验证ST2缺失的巨噬细胞能否抑制体内肿瘤生长。
构建原位肺癌模型，尾静脉注射WT或St2−/− BMDM，检测肿瘤体积、CD31表达及ST2+ AAM比例。
IL-33过表达对肿瘤微环境的影响
研究肿瘤细胞分泌的IL-33对肿瘤生长及免疫细胞浸润的影响。
使用慢病毒构建稳定表达flIl33、cIl33的Lewis细胞，皮下接种WT小鼠，分析肿瘤体积、IL-33水平和免疫细胞比例。
IL-33对巨噬细胞极化的体外验证
确定肿瘤细胞分泌的IL-33是否通过ST2促进AAM极化。
将Lewis细胞与WT或St2−/− BMDM共培养48小时，检测AAM比例、CD206蛋白、Mrc1、Arg1、Tgfb mRNA及IL-33分泌。
PI3K/Akt通路机制验证
验证IL-33/ST2是否通过PI3K/Akt通路促进AAM极化。
RNA-seq分析WT、Il33Tg、St2−/− BMDM差异表达基因，Western blot检测共培养系统中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表达，并使用抑制剂验证。
巨噬细胞过表达IL-33的功能验证
验证巨噬细胞自身表达IL-33对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响。
将过表达flIl33、cIl33的BMDM与Lewis细胞共培养，检测Lewis细胞增殖和侵袭，以及与IL-4刺激后AAM极化相关基因表达。
AAM对T细胞功能的影响
研究IL-33/ST2诱导的AAM是否通过TGF-β抑制T细胞功能。
收集与Lewis细胞共培养的BMDM上清，刺激分选的CD4+和CD8+ T细胞，检测效应分子、抑制受体及Treg分化，并用TGF-β中和抗体验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sartorius CellGenix GmbH | -- |
| 胎牛血清 | Sartorius | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Solarbio | -- | |
| CO2培养箱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | 阿佛丁（2,2,2-三溴乙醇） | Sigma-Aldrich | -- |
| 康宁基质胶 | Corning | -- | |
| 免疫组化 | 抗CD31抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| DAB过氧化物酶底物 | Fuzhou Maixin Biotech. Co., Ltd | -- | |
| 免疫荧光 | 抗ST2抗体 | R&D Systems | -- |
| 抗CD206抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | Beyotime | -- | |
| 显微镜 | Olympus | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | Bioss | -- |
| 侵袭实验 | 8μm孔径Transwell小室 | LABSELECT | -- |
| 慢病毒包装 | pMD2G质粒 | HanBio Biotechnology | -- |
| psPAX2质粒 | HanBio Biotechnology | -- | |
| 转染试剂 | Yeasen | -- | |
| 聚凝胺 | Yeasen | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式细胞术 | FcR封闭试剂 | Miltenyi Biotec | -- |
| APC抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | -- | |
| PerCP抗小鼠F4/80抗体 | BD Biosciences | -- | |
| PE抗小鼠CD206抗体 | BD Biosciences | -- | |
| FITC抗小鼠CD11c抗体 | BD Biosciences | -- | |
| PE抗小鼠NK1.1抗体 | BD Biosciences | -- | |
| PE抗小鼠B220抗体 | BD Biosciences | -- | |
| PE抗小鼠CD3抗体 | eBioscience | -- | |
| FITC抗小鼠CD4抗体 | eBioscience | -- | |
| PerCP-Cy5.5抗小鼠CD8抗体 | eBioscience | -- | |
| APC抗小鼠CD279（PD-1）抗体 | BioLegend | -- | |
| PerCP抗小鼠CTLA4抗体 | BioLegend | -- | |
| PE抗小鼠IFNγ抗体 | eBioscience | -- | |
| PE抗小鼠穿孔素抗体 | eBioscience | -- | |
| PE抗小鼠Foxp3抗体 | BioLegend | -- | |
| 流式细胞仪 | Guava Technologies | -- | |
| ELISA | TGF-β ELISA试剂盒 | Solarbio | -- |
| IL-33 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 酶标仪（EPOCH2） | BioTek | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| cDNA合成试剂盒 | TOLO Biotechnology | -- | |
| SYBR Green预混液 | Takara | -- | |
| 实时荧光定量PCR仪（Agilent Mx3000P） | Agilent | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Biomed | -- | |
| PVDF膜 | Merck | -- | |
| 抗CD206抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗PI3K抗体 | ZenBio Science | -- | |
| 抗磷酸化PI3K抗体 | Affinity Biosciences | -- | |
| 抗Akt抗体 | ZenBio Science | -- | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | ZenBio Science | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Wuhan Sanying | -- | |
| HRP标记二抗 | Bioss | -- | |
| 增强化学发光检测试剂 | Sparkjade | -- | |
| RNA-seq | Agilent Bioanalyzer 2100 | Agilent | -- |
| Illumina HighSeq 4000 | Illumina | -- | |
| 共培养 | 0.4μm孔径Transwell小室 | LABSELECT | -- |
| 抑制剂处理 | PI3K-IN-1抑制剂 | MCE | HY-12068 |
| T细胞分选 | EasySep™小鼠CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL | -- |
| EasySep™小鼠CD4+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL | -- | |
| Dulbecco磷酸盐缓冲液 | Servicebio | -- | |
| T细胞刺激 | TGF-β中和抗体 | BioLegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与BMDM分化 | Lewis细胞、L929、293T细胞来源；BMDM分化条件（30% L929条件培养基，7天）；培养基成分（DMEM+10%FBS+1%青链霉素） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 动物模型 | 小鼠品系（WT、Il33Tg、Il33−/−、St2−/−）；接种细胞数（皮下1×10^6，原位2×10^5）；肿瘤体积计算公式；麻醉用药（Avertin）及剂量；分组和注射时间 阅读提示：Methods: Animals and tumor models |
| 巨噬细胞过表达 | 慢病毒包装质粒（flIl33、cIl33全长1-266aa和109-266aa）；转染试剂；筛选药物（嘌呤霉素）及浓度；稳定细胞系构建时间 阅读提示：Methods: Lentiviral packaging and overexpression assay |
| 共培养体系 | Transwell孔径（0.4μm）；细胞比例（Lewis 2×10^4或1×10^5）；共培养时间（48小时）；PI3K/Akt抑制剂（PI3K-IN-1，货号HY-12068）的使用浓度 阅读提示：Methods: Macrophage and Lewis cell co-culture |
| 流式细胞术分析 | 抗体克隆及荧光标记（CD45-APC、F4/80-PerCP、CD206-PE等）；细胞表面和胞内染色步骤；固定和透化方法 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis |
| T细胞功能实验 | T细胞分选试剂盒来源；分选纯度；与BMDM上清共培养时间（72小时）；流式抗体（IFNγ、perforin、Foxp3等） 阅读提示：Methods: T cell sorting, Supernatants stimulate T cells |