FAM50A作为新型预后标志物通过CylinA2/CDK2通路调节结直肠癌细胞的增殖

FAM50A as a novel prognostic marker modulates the proliferation of colorectal cancer cells via CylinA2/CDK2 pathway.

作者信息Longhai Li, Zhaoshuai Ji, Guangyun Li, Hao Gu, Yan Sun
PMID39999107
期刊PLoS One
发布时间2025-02
DOI10.1371/journal.pone.0318776

实验完整度

包括数据库分析、临床样本IHC、细胞增殖功能实验、流式细胞术和WB机制验证,但缺乏动物模型和直接相互作用验证。

主要模型

SW480细胞系 HCT-8细胞系 RKO细胞系 145例结直肠癌患者样本

重点核对

TCGA和GTEx数据库分析FAM50A表达 IHC验证145例CRC组织中FAM50A蛋白表达 CCK-8、EdU和集落形成实验评估细胞增殖 流式细胞术检测细胞周期变化 Western blot检测CyclinA2和CDK2表达

摘要

目的:结直肠癌(CRC)是第三大常见的恶性肿瘤类型,也是癌症相关死亡的第二大原因。序列相似性家族50成员A(FAM50A)在多种疾病过程中发挥重要作用,包括肿瘤进展。本研究旨在评估FAM50A在CRC中的预后意义,并探讨其在CRC细胞增殖中的作用。方法:使用TCGA和GTEX数据库及免疫组织化学染色(IHC)研究FAM50A在CRC组织中的表达。使用患者生存数据通过Kaplan-Meier分析和Cox回归分析评估FAM50A在CRC中的预后意义。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)和集落形成实验评估FAM50A对肿瘤细胞增殖的影响。流式细胞术检测细胞周期的变化。通过蛋白质印迹法(WB)测量细胞周期和周期相关蛋白,以探索涉及癌症进展的潜在机制。结果:IHC结果显示,与相邻正常组织相比,CRC组织中FAM50A表达水平显著上调。此外,在145例CRC患者中,FAM50A表达与N分期和TNM分期呈正相关。Cox回归分析和列线图的构建表明,FAM50A高表达是CRC患者总生存期不良的预后指标。敲低FAM50A降低了细胞增殖能力、EdU阳性细胞比例和CRC细胞集落数量,而过表达FAM50A则促进增殖表型。敲低FAM50A导致处于S期的细胞数量显著增加。同时,敲低FAM50A后,CyclinA2和CDK2显著降低。结论:FAM50A可能是CRC的一种新型预后标志物,并可能通过靶向CyclinA2/CDK2信号通路参与调节肿瘤进展。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
FAM50A在结直肠癌中的表达及预后意义,以及其是否通过CyclinA2/CDK2通路调节细胞增殖。
核心机制
FAM50A可能通过靶向CyclinA2/CDK2信号通路促进CRC细胞增殖,敲低FAM50A导致S期阻滞并下调CyclinA2和CDK2表达。
主要证据
IHC显示FAM50A在CRC组织中高表达,且与N和TNM分期相关;高表达与较差的总生存期相关;敲低FAM50A抑制细胞增殖并诱导S期阻滞,同时下调CyclinA2和CDK2。
研究意义
FAM50A可能作为CRC的新型预后标志物,并为CRC治疗提供潜在靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

数据库表达分析

评估FAM50A在泛癌及结直肠癌组织中的mRNA表达水平。

从TCGA和GTEx数据库提取数据分析FAM50A表达,并利用limma等R包进行统计分析。

2

免疫组织化学验证

验证FAM50A蛋白在结直肠癌组织中的表达水平。

对145例CRC患者的肿瘤组织和相邻正常组织进行IHC染色,评估FAM50A表达。

3

临床相关性及预后分析

分析FAM50A表达与临床病理特征及预后的关系。

使用Wilcoxon检验、Kaplan-Meier分析、Cox回归和列线图评估FAM50A表达与临床特征及总生存期的关联。

4

细胞系构建与验证

构建FAM50A敲低和过表达的稳定细胞系,并验证效率。

使用慢病毒载体pLKO.1-shFAM50A和pCDH-puro-FAM50A转染SW480、HCT-8和RKO细胞,通过qRT-PCR和WB验证效率。

5

细胞增殖功能实验

检测FAM50A对CRC细胞增殖能力的影响。

通过CCK-8、EdU和集落形成实验评估FAM50A敲低和过表达对细胞增殖的影响。

6

细胞周期检测

检测FAM50A敲低对细胞周期分布的影响。

使用流式细胞术分析PI染色的细胞周期分布。

7

周期相关蛋白检测

检测FAM50A敲低后周期相关蛋白表达变化。

通过Western blot检测CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin C、Cyclin D和β-tubulin的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗FAM50A抗体Biossbs-8208R
抗FAM50A抗体Proteintech19849-1-AP
抗CDK2抗体Proteintech60312-1-Ig
抗Cyclin A2抗体Proteintech66391-1-Ig
RNA提取试剂盒BioscienceMN-MS-RNA-250
Prime Script RT和SYBR Premix Ex Taq试剂盒Vazyme--
RIPA裂解液Beyotime BiotechnologyP0013B
BCA蛋白定量试剂盒Beyotime BiotechnologyP0010
HRP标记的二抗Beyotime BiotechnologyA0208
HRP标记的二抗Beyotime BiotechnologyA0216
PI染色液Beyotime BiotechnologyC1052
DMEM培养基----
胎牛血清----
CytoFlex流式细胞仪Beckman Coulter--
酶标仪Thermo Fisher Scientific--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
临床样本收集
纳入患者时间、样本量、伦理批准编号
阅读提示:Methods 2.2
免疫组织化学
一抗浓度、抗原修复方法、染色定量标准
阅读提示:Methods 2.2
细胞培养
细胞系来源、培养基成分、培养条件
阅读提示:Methods 2.4
基因敲低/过表达
shRNA靶序列、质粒构建、病毒包装细胞
阅读提示:Methods 2.4,Table 1
细胞增殖检测
细胞接种密度、CCK-8检测时间点、EdU浓度和孵育时间、集落培养天数
阅读提示:Methods 2.7-2.9
细胞周期检测
细胞固定条件、PI染色浓度孵育时间、流式细胞仪型号
阅读提示:Methods 2.10
蛋白质印迹
一抗浓度、二抗浓度、内参选择
阅读提示:Methods 2.6