DNAH10新型双等位基因变异导致精子鞭毛多发形态异常和男性不育

Novel bi-allelic variants in DNAH10 lead to multiple morphological abnormalities of sperm flagella and male infertility.

作者信息Muhammad Shoaib, Muhammad Zubair, Wasim Shah, Meftah Uddin, Ansar Hussain, Ghulam Mustafa, Fazal Rahim, Huan Zhang, Imtiaz Ali, Tanveer Abbas, Yousaf Raza, Sui-Xing Fan, Qing-Hua Shi

PMID39996363

期刊Asian J Androl

发布时间2025-07-01

DOI10.4103/aja2024116

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实验完整度

中

包含临床表型分析、WES与Sanger验证、H&E形态学分析、免疫荧光定位验证，但缺乏功能实验或动物模型验证。

主要模型

患者精子样本（P1、P2、P3）正常生育对照精子样本

重点核对

WES鉴定DNAH10复合杂合变异：家族1为c.9409C>A和c.12946G>C，家族2为c.8849G>A和c.11059C>T Sanger测序验证常染色体隐性遗传模式精子形态学分析（H&E染色）显示鞭毛异常比例显著升高免疫荧光显示DNAH10蛋白信号沿精子鞭毛缺失精液参数：精子浓度正常，但前向运动力和总活力显著降低

摘要

精子鞭毛多发形态异常（MMAF）是一种严重的弱畸形精子症，以精子形态异常和活力降低为特征，导致男性不育。尽管约60%的MMAF病例可以从遗传学上解释，但其余病例的病因尚不清楚。在此，我们通过全外显子测序（WES）在两个无关的巴基斯坦家系的三名患者中鉴定出动力蛋白轴丝重链10（DNAH10）基因的两个新的复合杂合变异，包括家系1中的一个复合杂合突变（DNAH10: c.9409C>A [p.P3137T]; c.12946G>C [p.D4316H]）和家系2中的另一个复合杂合突变（DNAH10: c.8849G>A [p.G2950D]; c.11509C>T [p.R3687W]）。所有已鉴定的变异在公共基因组数据库中均不存在或罕见，并且根据多种生物信息学工具预测具有有害效应。Sanger测序显示这些变异遵循常染色体隐性遗传模式。苏木精和伊红（H&E）染色显示MMAF，包括患者精子头部异常。此外，免疫荧光染色显示沿精子鞭毛的DNAH10蛋白信号丢失。这些发现拓宽了DNAH10变异的谱系，并扩展了对与MMAF表型相关的男性不育遗传基础的理解。

样本收集与临床评估

确定患者的不育表型和精液特征。

招募两个巴基斯坦家系共3名不育男性患者（P1、P2、P3），收集精液和血液样本，进行精液分析，评估精子浓度、活力和形态。

全外显子测序与变异筛选

鉴定导致MMAF的遗传变异。

对家系1的P1和家系2的P2、P3及其家庭成员进行WES，通过过滤筛选DNAH10错义变异，并用Sanger测序验证。

变异致病性分析

评估新变异对DNAH10蛋白结构稳定性和进化保守性的影响。

使用PolyPhen-2、SIFT、MutationTaster预测变异有害性，用MUpro和I-Mutant2.0预测蛋白稳定性，并进行跨物种保守性分析。

精子鞭毛形态分析

评估DNAH10变异患者的精子形态学异常。

对患者和生育对照的精子进行H&E染色，统计鞭毛缺陷（短、弯曲、卷曲、不规则、缺失）和头部异常的比例。

DNAH10蛋白定位分析

验证DNAH10变异是否影响蛋白在鞭毛上的定位。

对患者和对照精子进行免疫荧光染色，检测DNAH10（抗DNAH10抗体）和α-tubulin（抗α-tubulin抗体）的定位。

实验环节	名称	品牌	货号
DNA提取	QIAamp DNA血液迷你试剂盒	QIAGEN	51206
WES建库	AIExome富集试剂盒V1	iGeneTech	--
WES测序	HiSeq2000	Illumina	--
免疫荧光染色	抗DNAH10抗体	Bioss	bs-11022R
抗α-微管蛋白抗体	Sigma-Aldrich	F2168
Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠IgG	Invitrogen	A21121
Alexa Fluor 555偶联的驴抗兔IgG	Invitrogen	A31572
VECTASHIELD封片剂	Vector Laboratories	H-1000
Hoechst 33342	Invitrogen	H21492
显微镜成像	尼康ECLIPSE 80i显微镜	Nikon	--

实验环节

名称

品牌

货号

DNA提取

QIAamp DNA血液迷你试剂盒

QIAGEN

51206

WES建库

AIExome富集试剂盒V1

iGeneTech

WES测序

HiSeq2000

Illumina

免疫荧光染色

抗DNAH10抗体

Bioss

bs-11022R

抗α-微管蛋白抗体

Sigma-Aldrich

F2168

Alexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠IgG

Invitrogen

A21121

Alexa Fluor 555偶联的驴抗兔IgG

Invitrogen

A31572

VECTASHIELD封片剂

Vector Laboratories

H-1000

Hoechst 33342

Invitrogen

H21492

显微镜成像

尼康ECLIPSE 80i显微镜

Nikon

环节	核对要点
样本收集	患者来源（两个巴基斯坦家系），精液采集需禁欲至少5天，血液样本用于DNA提取阅读提示：Methods: Sample collection
WES与变异鉴定	WES平台（HiSeq2000），捕获试剂盒（AIExome Enrichment Kit V1），比对基因组（GRCh37），变异过滤流程（见补充图1）阅读提示：Methods: WES, gene filtration, and Sanger sequencing; Supplementary Figure 1
Sanger测序验证	引物序列（见补充表1），验证家系成员包括III:1, III:2, IV:2, IV:6等，确认复合杂合变异及隐性遗传阅读提示：Methods: WES, gene filtration, and Sanger sequencing; Figure 1c, d; Supplementary Table 1
精子形态分析	H&E染色，统计约200个精子，记录鞭毛缺陷类型（短、弯曲、卷曲、不规则、缺失）和头部异常比例，正常对照与患者比较，使用Student's t-test 阅读提示：Methods: Semen and sperm morphology analysis; Figure 3; Supplementary Table 4
免疫荧光染色	精子涂片制备，固定（4%多聚甲醛），通透（0.1% Triton X-100），封闭（3%脱脂牛奶），一抗浓度（抗DNAH10 1:100，抗α-tubulin 1:200），二抗浓度（1:100或1:200），成像设备阅读提示：Methods: Immunostaining; Figure 4

环节

核对要点

样本收集

患者来源（两个巴基斯坦家系），精液采集需禁欲至少5天，血液样本用于DNA提取

阅读提示：Methods: Sample collection

WES与变异鉴定

WES平台（HiSeq2000），捕获试剂盒（AIExome Enrichment Kit V1），比对基因组（GRCh37），变异过滤流程（见补充图1）

阅读提示：Methods: WES, gene filtration, and Sanger sequencing; Supplementary Figure 1

Sanger测序验证

引物序列（见补充表1），验证家系成员包括III:1, III:2, IV:2, IV:6等，确认复合杂合变异及隐性遗传

阅读提示：Methods: WES, gene filtration, and Sanger sequencing; Figure 1c, d; Supplementary Table 1

精子形态分析

H&E染色，统计约200个精子，记录鞭毛缺陷类型（短、弯曲、卷曲、不规则、缺失）和头部异常比例，正常对照与患者比较，使用Student's t-test

阅读提示：Methods: Semen and sperm morphology analysis; Figure 3; Supplementary Table 4

免疫荧光染色

精子涂片制备，固定（4%多聚甲醛），通透（0.1% Triton X-100），封闭（3%脱脂牛奶），一抗浓度（抗DNAH10 1:100，抗α-tubulin 1:200），二抗浓度（1:100或1:200），成像设备

阅读提示：Methods: Immunostaining; Figure 4

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